Avaliação do influxo de cálcio induzido por receptor de células T usando um corante indicador de cálcio

Comece com uma suspensão de células T de camundongo e introduza um corante indicador de cálcio - éster Indo-1-acetoximetílico.

O corante entra nas células, onde as esterases intracelulares clivam o grupo acetoximetil para formar Indo-1 impermeável à membrana, que exibe fluorescência distinta nas formas livre de cálcio e ligada ao cálcio.

Adicione anticorpos do receptor Fc para bloquear locais de interação inespecíficos.

Introduza anticorpos marcados com fluoróforo para corar subconjuntos de células T.

Remova os anticorpos não ligados e core com um corante de viabilidade que cora diferencialmente as células vivas e mortas.

Na citometria de fluxo, detecte inicialmente a fluorescência fraca de células vivas e identifique células T marcadas com fluoróforo, seguido pela medição da fluorescência Indo-1 dentro dessas células.

Trate com anticorpos anti-CD3, que interagem com o complexo receptor de células T CD3 e ativam as vias de sinalização das células T, induzindo o influxo de cálcio no citosol.

O corante Indo-1 interage com os íons de cálcio liberados, mudando a fluorescência do corante de azul para violeta.

A mudança na fluorescência do Indo-1 de estados livres de cálcio para estados