Avaliação do influxo de cálcio induzido por receptor de células T usando um corante indicador de cálcio

Comece com uma suspensão de células T de camundongo e introduza um corante indicador de cálcio - éster Indo-1-acetoximetílico.

O corante entra nas células, onde as esterases intracelulares clivam o grupo acetoximetil para formar Indo-1 impermeável à membrana, que exibe fluorescência distinta nas formas livre de cálcio e ligada ao cálcio.

Adicione anticorpos do receptor Fc para bloquear locais de interação inespecíficos.

Introduza anticorpos marcados com fluoróforo para corar subconjuntos de células T.

Remova os anticorpos não ligados e core com um corante de viabilidade que cora diferencialmente as células vivas e mortas.

Na citometria de fluxo, detecte inicialmente a fluorescência fraca de células vivas e identifique células T marcadas com fluoróforo, seguido pela medição da fluorescência Indo-1 dentro dessas células.

Trate com anticorpos anti-CD3, que interagem com o complexo receptor de células T CD3 e ativam as vias de sinalização das células T, induzindo o influxo de cálcio no citosol.

O corante Indo-1 interage com os íons de cálcio liberados, mudando a fluorescência do corante de azul para violeta.

A mudança na fluorescência do Indo-1 de estados livres de cálcio para estados ligados ao cálcio confirma o influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T.

Para começar, prepare uma solução estoque de 1 micrograma por microlitro de Indo-1 AM adicionando 50 microlitros de DMSO em um frasco, contendo 50 microgramas de Indo-1 AM. Diluir a solução-mãe num volume adequado de cRPMI a uma concentração de 6 microgramas por mililitro.

Coloque o meio em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, use este meio para diluir uma suspensão celular previamente preparada na proporção de 1 para 1 para obter 5 a 6 milhões de células por mililitro. Em seguida, em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, adicione 1 mililitro de suspensão celular por poço, por condição experimental.

Prepare uma amostra de controle de coloração única para Indo-1 AM livre de cálcio adicionando EGTA a células carregadas de corante Indo-1. Repare um poço para controle biológico negativo sem fluoróforos ou corante Indo-1. Preparar um controlo positivo Indo-1 adicionando ionomicina a uma concentração de 50 micromoles à suspensão de células carregadas de corante no citómetro de fluxo.

Além disso, prepare um poço para controles de coloração única para populações de células adicionais, usando fluoróforos conjugados com anticorpos. Em seguida, adicione 2 microgramas de anticorpo bloqueador do receptor FC por milhão de células e incube a placa por 45 minutos, batendo a cada 15 minutos para ressuspender as células.

Após a incubação, misture e remova todo o volume de células da placa e adicione-o a tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Centrifugue e decanta o sobrenadante. Uma vez que as células são lavadas com 1 mililitro de cRPMI pré-aquecido, pellet novamente e decanta o sobrenadante.

Ressuspenda as células em 1 mililitro de cRPMI e incube cada tubo, deixando a parte superior do tubo ligeiramente aberta para a troca gasosa, permitindo a desesterificação completa dos ésteres AM intracelulares. Em seguida, prepare uma mistura principal de todos os anticorpos conjugados com fluorocromo definidos pelo usuário e adicione-a às células em repouso para 1 mililitro do volume celular.

Após o repouso, jogue as células e lave o pellet ressuspendendo em 1 mililitro de cRPMI resfriado a 4 graus Celsius. Repita esta etapa e coloque os tubos no gelo. Ressuspenda amostras individuais em 500 microlitros de cRPMI sem vermelho de fenol, usando um tubo de fluxo de poliestireno de 5 mililitros com tampa.

Para manter a temperatura usando a análise de fluxo de cálcio, prepare um banho de esferas adicionando contas de banho a um pequeno banho-maria e aqueça-o até 37 graus Celsius. Corte cuidadosamente um tubo cônico de 50 mililitros ao meio e descarte a parte superior do tubo. Encha 3/4 do tubo restante com contas de banho e deixe-o atingir 37 graus Celsius no banho de contas.

Coloque o banho de esferas perto de um citômetro de fluxo, junto com um rack de isopor para posicionar o tubo. Antes da análise no citómetro de fluxo, aquecer os tubos individualmente a 37 graus Celsius durante sete minutos. Faça login no software do citômetro de fluxo e clique na guia Biblioteca.

Em seguida, selecione tags fluorescentes para adicionar Indo-1 ligado a cálcio e Indo-1 sem cálcio. Em seguida, selecione Laser UV em grupos de tags fluorescentes e clique em Adicionar mais para adicionar um nome de tag fluorescente. Escolha a excitação do laser e o comprimento de onda de emissão e clique em Salvar.

Continue para a configuração experimental. clique na guia Aquisição. Abra ou crie um novo experimento e adicione as tags fluorescentes desejadas ao experimento. Crie um grupo de referência e um novo grupo de amostra para o experimento e rotule ambos os grupos.

Na guia Aquisições, defina os eventos a serem gravados no máximo em 10 milhões, o volume de parada no volume máximo de 3.000 microlitros e o tempo de parada no máximo de 36.000 segundos. Adquira controles de coloração única para anticorpos conjugados definidos pelo usuário, incluídos no painel multicolorido, e para o corante funcional Indo-1.

Adicione 50 micromoles de ionomicina ao controle positivo e vórtice Indo-1 ligado ao cálcio. Adicione o tubo de fluxo à placa de injeção de amostra e clique em Gravar. Em seguida, adicione o controle negativo Indo-1 livre de cálcio ao citômetro de fluxo e clique em Gravar.

Desmisture os controles de coloração única clicando no botão Desmixar. Quando a mistura estiver concluída, crie gráficos sequenciais usando a planilha não misturada, como SSCA versus FSCA para remover detritos da amostra e SSCA versus SSCH para remover dublês.

Em seguida, crie portões clicando em Plotar. Adicione um gráfico à planilha e clique duas vezes dentro do portão para criar uma população fechada a jusante. Continue até que todas as populações de interesse sejam contabilizadas. Em seguida, aqueça as amostras de controle de coloração única previamente preparadas a 37 graus Celsius para análise sequencial.

Configure o software de citometria de fluxo e deixe a água deionizada funcionar por 2 a 3 minutos para garantir a estabilidade fluídica do citômetro de fluxo. Configure gráficos sequenciais na planilha não misturada criando portões usando os botões de portão de polígono, retângulo ou elipse para incluir a população de interesse.

Clique duas vezes dentro do portão e altere os parâmetros dos eixos y e x para SSCA versus SSCH. Conclua a definição dos parâmetros do eixo clicando com o botão esquerdo do mouse no eixo. Crie um gráfico com SSCA versus sinal de corante de viabilidade. Bloqueie as células vivas, que são negativas ou corantes de amina.

As células vivas negativas para coloração de mortos-vivos se agruparão na marca zero nos eixos y e x. Clique duas vezes no gráfico interno para criar um novo gráfico, contendo apenas linfócitos vivos de célula única. Altere o eixo y para um versus tempo no eixo x para visualização do influxo de cálcio.

Em seguida, coloque a amostra biológica aquecida no SIT da máquina. Execute as amostras em 2.500 a 3.000 eventos por segundo em uma taxa de fluxo média para visualizar o influxo de cálcio em um número limitado de populações de células. Adicione o próximo tubo ao banho de contas.

Em Controle de aquisição, pressione Gravar para registrar os dados iniciais por 30 segundos para obter um nível basal de sinalização de cálcio na amostra. Em seguida, clique em Parar e remova o tubo da porta de injeção de amostra. Adicione 30 microgramas de anti-CD3 não conjugado diretamente no tubo de amostra para iniciar o influxo de cálcio.

Coloque rapidamente o tubo de volta na porta de injeção de amostra e pressione Gravar no software. Registre dados por sete minutos, observando o tempo decorrido sob os controles de aquisição no software. Em seguida, pressione Parar no software.