Um ensaio para quantificar a ligação de VLPs de norovírus humano a bactérias intestinais

Pegue um tubo contendo uma suspensão de bactérias intestinais humanas.

Adicione partículas semelhantes a vírus de norovírus humano, ou VLPs. As VLPs contêm um capsídeo viral intacto, mas não possuem RNA genômico, tornando-as não infecciosas para os seres humanos.

Durante a incubação, as proteínas do capsídeo VLP se ligam a carboidratos específicos expressos na superfície bacteriana, formando complexos VLP-bactérias.

Centrifugue para pellet os complexos e descarte os VLPs não ligados.

Introduzir uma solução de bloqueio contendo proteínas para bloquear locais de ligação de anticorpos não específicos, reduzindo a coloração de fundo nas etapas subsequentes.

Adicione anticorpos específicos para VLP marcados com fluorescência e incuba.

Os anticorpos se ligam aos seus locais-alvo no capsídeo VLP, rotulando os complexos VLP-bactérias.

Centrifugue para peletar os complexos. Descarte os anticorpos não ligados e ressuspenda o pellet em um tampão de citometria de fluxo.

Usando um citômetro de fluxo, detecte sinais de fluorescência emitidos por complexos de bactérias VLP, permitindo a quantificação da porcentagem de bactérias ligadas na amostra.

Depois de preparar os reagentes, anticorpos e bactérias conforme descrito no manuscrito, monte todos os materiais em um gabinete de biossegurança BSL II.

Partículas semelhantes a vírus para norovírus humano são listadas como patógenos BSL II, e todo o trabalho realizado usando VLPs deve ser conduzido em um gabinete de biossegurança certificado.

Adicione 10 microgramas de VLPs de norovírus humano a cada tubo de bactéria e misture bem pipetando. Incube os tubos por 1 hora a 37 graus Celsius com rotação constante. Após a incubação, centrifugue os tubos a 10.000 vezes g por 5 minutos.

Aspirar e rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento bacteriano em 1 mililitro de PBS. Depois de repetir as etapas de lavagem uma vez, centrifugue os tubos novamente a 10.000 vezes g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de bactérias VLP em 150 microlitros de tampão de bloqueio a 5%.

Um erro comum que ocorre é que os tubos são trocados e o tratamento errado é adicionado. Para evitar isso, organize todos os tubos em linhas que correspondam ao tratamento correto e adicione um tratamento de uma só vez aos tubos.

Para cada amostra bacteriana, prepare 50 microlitros de anticorpo G2 de norovírus humano diluído. Usando tampão de bloqueio de 5%, dilua o anticorpo 1 a 125 para amostras de casos de E. coli. Preparar 50 microlitros de anticorpo isotipo diluído para cada amostra bacteriana utilizando as mesmas proporções de diluição. Divida cada amostra de ensaio de fixação em alíquotas de 350 microlitros, transferindo-as para tubos de centrífuga limpos de 1,5 mililitro.

Para criar controles não corados, adicione 50 microlitros de tampão de bloqueio à primeira alíquota de cada amostra bacteriana. Para as amostras coradas, adicione 50 microlitros da diluição do anticorpo G2 ao segundo conjunto de alíquotas. Crie os controles de isotipo adicionando 50 microlitros do anticorpo de isotipo diluído ao terceiro conjunto de alíquotas.

Incubar todas as amostras no gelo e no escuro durante 30 minutos. Em seguida, centrifugue todas as amostras a 10.000 vezes g por 5 minutos. Rejeitar os sobrenadantes e ressuspender cada amostra em 150 microlitros de FCSB. Novamente, centrifugue todas as amostras a 10.000 vezes g por 5 minutos. Novamente, descarte os sobrenadantes e ressuspenda as amostras em 100 microlitros de FCSB.

Depois de centrifugar as amostras uma última vez e descartar o sobrenadante, ressuspender as amostras em 150 microlitros de FCSB. Transfira cada amostra para um tubo contendo 400 microlitros de FCSB para um volume total de 550 microlitros. Armazene as amostras a 4 graus Celsius até que sejam analisadas por citometria de fluxo.