Um ensaio in vivo para detectar mitofagia em nematóides transgênicos

Pegue os nematóides transgênicos, com células musculares da parede corporal expressando DCT-1 marcada com fluoróforo verde, uma proteína de membrana mitocondrial externa, e uma LGG-1 marcada com fluoróforo vermelho, uma proteína de membrana de fagóforo.

Coloque os vermes em cima de um meio de crescimento contendo uma droga indutora de mitofagia.

A droga danifica as mitocôndrias celulares, iniciando a mitofagia ou a depuração seletiva das mitocôndrias danificadas.

DCT-1 em mitocôndrias danificadas sofre ubiquitinação e fosforilação, facilitando a interação com LGG-1 na membrana do fagóforo.

O fagóforo se expande ao redor das mitocôndrias para formar um autofagossomo direcionado para degradação lisossômica.

Coloque os nematóides em um anestésico em uma lâmina de microscópio para imobilizá-los e coloque uma lamínula.

Sob um microscópio de fluorescência, visualize manchas amarelas dentro das células musculares, indicando a co-localização de DCT-1 emitindo fluorescência verde e LGG-1 exibindo fluorescência vermelha. Isso confirma a ocorrência de mitofagia.

No primeiro dia, escolha larvas L4 de animais transgênicos expressando DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em células musculares da parede cor