Um imunoensaio de eletroforese capilar para detecção de biomarcadores de proteínas

Para detectar um biomarcador de proteína associado à doença, pegue uma placa de imunoensaio.

A placa contém matrizes de separação e empilhamento pré-preenchidas necessárias para a separação de proteínas com base no tamanho.

Carregue as proteínas e os reagentes de imunoensaio em poços de placas distintos.

Inicie a execução dentro de um analisador CEI. O cartucho capilar no analisador aspira as matrizes para formar um gel dentro de cada capilar.

O capilar então aspira as proteínas. Durante a eletroforese, as proteínas migram e se separam com base em seus pesos moleculares.

O analisador introduz luz UV, imobilizando as proteínas no capilar.

O tampão de lavagem remove as matrizes e proteínas não ligadas. O buffer de bloqueio então flui, bloqueando sites de interação não específicos.

O analisador introduz anticorpos primários que se ligam ao biomarcador, seguidos por anticorpos secundários conjugados com peroxidase interagindo com os anticorpos primários.

Lave e adicione o substrato de quimioluminescência. A peroxidase oxida o substrato, emitindo luminescência.

Meça a intensidade da luminescência e compare-a com o padrão de proteína para detecção de biomarcadores.

Depois de coletar 100 microlitros de lisados de plaquetas humanas de pacientes com ELA e indivíduos saudáveis, preencha os modelos gerados internamente para o layout capilar e a preparação da amostra. A tabela de preparação da mistura de amostras é dinâmica e calculará automaticamente quanto volume deve ser removido da fonte. Colocar todos os reagentes de doseamento no gelo, excepto a embalagem normal, que deve permanecer à temperatura ambiente.

Para preparar a mistura principal fluorescente, adicione 40 microlitros de água deionizada a um tubo transparente de TDT e adicione 20 microlitros de tampão de amostra 10X e 20 microlitros da solução de TDT de 400 milimolares preparada ao tubo rosa do kit de ensaio.

Para preparar a escada biotinilada, adicione 16 microlitros de água deionizada, 2 microlitros de tampão de amostra 10X e 2 microlitros da solução DTT 400 milimolar preparada ao tubo branco fornecido no kit. Após uma mistura suave, transfira a solução em escada para um tubo de PCR de 200 microlitros antes de desnaturar.

Adicione 1,5 microlitros de tampão de amostra 10X e 148,5 microlitros de água deionizada a um tubo de microcentrífuga de 600 microlitros. e vórtice para misturar, antes de colocar o tubo no gelo. Adicione os anticorpos de interesse diretamente ao diluente, conforme indicado na tabela, e lave a ponta da pipeta várias vezes para obter uma solução homogênea de anticorpos.

Para preparar a mistura de amostra capilar, abra todos os tubos de PCR e adicione alíquotas de 1,6 microlitro de tampão de amostra fluorescente 5X a cada tubo, conforme indicado na tabela, usando uma técnica de pipetagem reversa, fechando imediatamente cada tubo à medida que o tampão é adicionado. Quando todo o buffer tiver sido adicionado, abra todos os tubos e adicione um buffer de amostra 0,1x em volumes conforme indicado na tabela, fechando imediatamente cada tubo à medida que o buffer é adicionado.

Em seguida, abra todos os tubos e adicione as amostras de proteína conforme indicado na tabela e feche imediatamente cada tampa do tubo. Quando todas as amostras tiverem sido adicionadas, centrifugue brevemente todos os tubos em uma centrífuga de bancada. Vórtice para misturar e centrifugar as amostras novamente.

No final da segunda centrifugação, coloque todos os tubos em um termociclador com tampa aquecida e desnature as amostras nas condições indicadas. No final da desnaturação, centrifugue, misture e centrifugue as amostras novamente e coloque todos os tubos em um suporte de tubos sobre gelo.

Utilizando a figura como guia, adicionar 10 microlitros de estreptavidina peroxidase de rábano ao poço D1, 10 microlitros do anticorpo secundário adequado aos alvéolos D2 a D5, 10 microlitros de diluente de anticorpos a cada alvéolo da fileira B e ao poço C1, 10 microlitros do anticorpo primário adequado aos alvéolos C2 a C25, 5 microlitros de escada biotinilada do tubo de PCR número 1 ao poço A1, 3 microlitros de amostra para as linhas A2 a A25 e 15 microlitros de peróxido de luminol recém-preparado para cada poço da linha E.

Pipetar a mistura de amostras e os reagentes no minúsculo poço nas ordens corretas é fundamental para o sucesso do experimento, por isso deve ser feito com muito cuidado.

Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem a cada poço de tampão de lavagem designado e gire o conteúdo da placa por centrifugação.