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Comece montando uma lâmina de ensaio de microarray pré-tratada com pontos distintos contendo anticorpos de captura específicos de proteínas para detecção de várias proteínas.
Colocar as diluições do padrão proteico e as amostras de soro pré-diluídas em alvéolos separados. Essas diluições criam uma faixa de concentrações de proteínas para uma quantificação precisa.
Incubar para facilitar as interações proteína-anticorpo. Lave para remover as proteínas não ligadas, desmonte e seque a lâmina.
Inverter a lâmina de ensaio num aparelho de encaixe contendo uma lâmina de transferência reidratada manchada com anticorpos de detecção biotinilados específicos de proteínas nas mesmas posições que a lâmina de ensaio.
Feche o aparelho e pressione para encaixar as lâminas umas sobre as outras. Isso facilita a transferência dos anticorpos de detecção para os pontos correspondentes na lâmina de ensaio, minimizando a reatividade cruzada.
Separe as lâminas para permitir a interação de anticorpos de detecção com proteínas ligadas, formando imunocomplexos.
Remonte a lâmina de ensaio, enxágue-a e introduza estreptavidina conjugada com fluoróforo, interagindo com anticorpos biotinilados.
Usando um scanner, detecte pontos de fluorescência em vários locais, indicando várias proteínas na amostra de soro. Compare as intensidades pontuais com o padrão para quantificação de proteínas.
Para iniciar o imunoensaio, remova a lâmina de ensaio preparada do freezer e deixe-a aquecer até a temperatura ambiente em seu saco lacrado por 30 minutos. Prepare sete soluções diluídas em série de proteínas em PBS com 0,05% de polissorbato-20. Preparar as soluções de amostra adequadamente diluídas no mesmo tampão.
Prenda uma junta de silicone de 24 poços na lâmina de ensaio à temperatura ambiente. Carregue as sete diluições de proteína em sete dos oito poços em uma coluna. Carregue PBS livre de proteína com 0,05% de polissorbato-20 no último poço dessa coluna. Carregue as soluções de amostra nos poços restantes.
Agite as lâminas a 450 RPM por 1 hora em temperatura ambiente ou a 4 graus Celsius durante a noite. Em seguida, lave a lâmina três vezes. Remova a junta e seque a lâmina sob uma corrente de gás nitrogênio.
Em seguida, deixe a lâmina de transferência de anticorpos de detecção aquecer até a temperatura ambiente por 30 minutos em seu saco lacrado. Em seguida, incube as lâminas por 20 minutos em uma câmara fechada com umidade relativa de 60% para reidratar as matrizes. Use os pinos pogo para fixar a corrediça de transferência de detecção voltada para cima no aparelho de encaixe.
Coloque a lâmina de ensaio voltada para baixo nos pinos pogo e alinhe a lâmina com os pinos retos. Feche o aparelho e transfira os anticorpos de detecção para a lâmina de ensaio. Remova as lâminas do aparelho e incube a lâmina de ensaio por uma hora.
Prenda uma junta de silicone de 24 poços na lâmina e lave a lâmina três vezes. Em seguida, carregue em cada poço 80 microlitros de uma solução de 2,5 microgramas por mililitro de fluoróforo de estreptavidina em PBS. Agite a lâmina a 450 RPM por 20 minutos.
Lave a lâmina três vezes com uma solução de polissorbato-20 a 0,1% em PBS e uma vez com água destilada. Em seguida, remova a junta e seque a lâmina. Digitalize a lâmina com um scanner fluorescente e meça as intensidades pontuais. Determinar os limites de detecção e as concentrações de proteínas.