Imagem de imunofluorescência multiplexada para analisar subpopulações de células T resistentes à imunoterapia

Pegue uma criossecção de tecido de carcinoma de células renais exibindo células T CD8 + infiltrantes em seu microambiente tumoral.

Trate-o com acetona para fixar e permeabilizar o tecido. Lave para remover o excesso de acetona.

Adicione avidina para saturar a biotina endógena do tecido. Em seguida, adicione biotina para bloquear os locais de ligação da avidina imobilizados, minimizando as interações não específicas.

Aplique soro contendo imunoglobulinas para bloquear os receptores Fc das células imunes, evitando a ligação inespecífica de anticorpos.

Adicione um coquetel de anticorpos primários direcionado ao CD8, um marcador de células T citotóxicas, e PD-1 e Tim-3, receptores inibitórios expressos por subpopulações de células T CD8+ resistentes à imunoterapia.

Introduzir anticorpos secundários marcados com fluoróforo distintos direcionados aos anticorpos anti-CD8 e anti-Tim-3.

Adicione anticorpos secundários biotinilados direcionados a anticorpos anti-PD-1 e uma estreptavidina marcada com fluoróforo diferente ligando-se à biotina.

Aplique um meio de montagem contendo corante nos núcleos das células de coloração e coloque uma lamínula.

Adquira imagens de fluorescência multiespectral para identificar as células T CD8+ infiltrantes de tumor e as subpopulações resistentes à imunoterapia que expressam PD-1, Tim-3 ou ambas.

Após o descongelamento, use uma toalha de papel para secar cuidadosamente as lâminas ao redor das seções de tecido e envolva os tecidos com uma caneta de barreira hidrofóbica. Quando a barreira secar, fixe as amostras em acetona 100% por 5 minutos, seguido de 2 minutos de secagem ao ar. Em seguida, lave as lâminas em TBS por 10 minutos.

Pré-trate as lâminas com três gotas de avidina a 0,1% por 10 minutos no escuro. Em seguida, toque ou mova as lâminas para cobrir o tecido com a solução de avidina. Adicione três gotas de 0,01% de biotina a cada amostra e bata ou mova a biotina nas amostras, seguida de uma lavagem TBS, como acabamos de demonstrar. Em seguida, bloqueie qualquer ligação inespecífica com 100 microlitros de soro normal a 5% em TBS por 30 minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, bata nas lâminas para remover o excesso de soro e incube as lâminas em 100 microlitros do coquetel de anticorpos primários de interesse por 1 hora em uma câmara umidificada. Lave as lâminas marcadas com anticorpos em TBST por 5 minutos.

Após a secagem, rotule as células com 100 microlitros do coquetel de anticorpos secundários de interesse por 30 minutos na câmara umidificada, seguido de uma lavagem de 10 minutos em TBS. Incube as lâminas marcadas com anticorpos secundários secos com 100 microlitros do coquetel de anticorpos terciários de interesse por 30 minutos, seguido por uma lavagem final de 10 minutos com TBS.

No final da lavagem, seque as lâminas e monte os lenços com o meio de montagem suplementado com DAPI. Em seguida, cubra cada slide com uma lamínula e deixe o meio de montagem endurecer por pelo menos 2 horas.

Para digitalizar as lâminas, abra o software do microscópio e carregue o protocolo de digitalização de imagem. Carregue a primeira lâmina na platina do microscópio. Em seguida, na barra de controle, clique em Definir exposição e ajuste o tempo de exposição para cada filtro até que um sinal suficiente, mas não saturante, seja obtido.

Clique em Iniciar no painel superior e abra a pasta ID do laboratório. Insira a ID do primeiro slide e clique em Avançar.

Para obter a visão geral da lâmina sob luz de campo brilhante com uma ampliação de 4x, clique em Imagem monocromática e Localizar amostra. Para selecionar a área de tecido a ser escaneada, pressione a tecla Control e use o cursor para selecionar ou desmarcar as regiões de interesse a serem escaneadas com ampliação de 4x.

Para obter uma imagem fluorescente vermelho-azul-verde de cada região, clique em Imagem de baixa potência. Para seleção de campo de alta potência, pressione a tecla Control e selecione pelo menos cinco regiões de interesse que correspondam às áreas do tecido que serão digitalizadas com ampliação de 20x.

Em seguida, para obter uma aquisição de imagem multiespectral de cada campo, clique em Imagens de alta potência e clique em Armazenamento de dados para armazenar as imagens na pasta de ID de laboratório apropriada.