Uma técnica de imunofluorescência para localização de proteínas virais em células infectadas

Comece com um slide contendo células hospedeiras aderidas.

Adicione vírus e permita que eles entrem nas células hospedeiras.

Remova o meio gasto. Adicione meio fresco para permitir a síntese e o transporte de proteínas virais.

Use paraformaldeído para preservar a morfologia celular e a localização da proteína.

Adicione moléculas de detergente para tornar as células permeáveis.

Aplique um buffer de bloqueio para bloquear sites de associação não alvo.

Adicione anticorpos primários que se ligam às proteínas virais alvo. Remova os anticorpos não ligados.

Sobreposição com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo vermelho para marcação fluorescente das proteínas virais. Remova os anticorpos não ligados.

Adicione um meio de montagem contendo corante nuclear fluorescente para manchar os núcleos.

Usando microscopia confocal, observe a localização das proteínas virais fluorescentes vermelhas e dos núcleos hospedeiros fluorescentes azuis.

Um sinal vermelho mais forte ao redor da área azul indica localização citoplasmática, enquanto um sinal mais forte no interior sugere localização nuclear.

Níveis de sinal iguais dentro e ao redor da área azul indicam que as proteínas estão localizadas no núcleo e no citoplasma.

20 a 24 horas antes da infecção pelo vírus, semeie 5 x 10⁴ células de pulmão embrionário humano ou fibroblastos HEL por poço em uma lâmina escalonada de 4 poços de 11 milímetros em meio de crescimento para incubação noturna a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono.

É importante balançar bem a lâmina para garantir uma distribuição uniforme das células, tomando cuidado para evitar derramar o meio de cultura. No dia seguinte, substitua os sobrenadantes das culturas confluentes de 70% a 80% por Medium-199 contendo 4-10 unidades formadoras de placa por célula e coloque a lâmina a 37 graus Celsius com agitação por 1 hora.

No final da incubação, substituir os sobrenadantes por meio de crescimento fresco e devolver as células à incubadora para o período de infecção experimental adequado. Para coloração por imunofluorescência das células infectadas pelo vírus, lave rapidamente as células três vezes com PBS, seguida de uma incubação de 8 a 10 minutos em 200 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS por poço. Ao final da fixação, lavar as células três vezes com 200 microlitros de PBS por lavagem e permeabilizar as células com 100 microlitros de surfactante não iônico a 0,2% por poço por 5 a 10 minutos.

Lave as células permeabilizadas três vezes em PBS, conforme demonstrado, e adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio a cada poço para uma incubação de 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a concentração apropriada do anticorpo primário de interesse a cada poço para uma incubação em temperatura ambiente de 2 horas.

No final da incubação, remova qualquer anticorpo primário não ligado com três lavagens de 10 minutos em tampão de bloqueio fresco e adicione um anticorpo secundário apropriado a cada poço para uma incubação de 1 hora à temperatura ambiente, protegida da luz.

No final da incubação, lave as células três vezes em um tampão de bloqueio, conforme demonstrado, seguido de uma lavagem em PBS e adicione uma gota de meio de montagem anti-desbotamento, complementado com DAPI em cada poço. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a lâmina e sele a lamínula com esmalte transparente.

Aplicar uma leve pressão durante a montagem da lamínula removerá qualquer excesso de meio de montagem, ajudando a garantir a aquisição de imagens de alta qualidade.

Para analisar a distribuição nuclear e citoplasmática da ICP0, abra o projeto no software aplicativo confocal e selecione uma imagem. Abra a guia Quantidade e selecione Classificar regiões de interesse no menu Ferramentas. Selecione Desenhar linha e desenhe uma linha longitudinal na célula a ser analisada. Um histograma aparecerá mostrando a intensidade de fluorescência ao longo da linha para a proteína de interesse e DAPI.

Com base na coloração de fundo, estabeleça um limite constante para a intensidade da proteína de interesse para análise da distribuição subcelular da proteína em cada experimento. Se o sinal da proteína, em média, estiver abaixo do limite na região nuclear, mas estiver acima do limite além do limite DAPI, categorize o sinal da proteína como predominantemente localizado dentro do citoplasma.

Se o sinal da proteína estiver acima do limiar em todo o núcleo e além do limite do sinal DAPI, agrupe o sinal da proteína como um núcleo mais localização citoplasmática. Se o sinal da proteína estiver acima do limite no núcleo, mas em média estiver abaixo do limite fora do limite do sinal DAPI, agrupe o sinal da proteína como uma localização nuclear.