Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:06 min. • December 23rd, 2025
Comece com uma suspensão fúngica de Cryptococcus. Adicione uma solução de biopartículas derivadas de fungos conjugadas com um corante fluorescente sensível ao pH para corar as células de Cryptococcus.
Lave para remover o corante não ligado. Transfira a suspensão fúngica corada para uma placa de vários poços com macrófagos aderidos - ou células imunes fagocíticas.
Introduza a concentração inibitória mínima de um medicamento, como aspirina ou ibuprofeno, e incube para facilitar a absorção do medicamento.
As moléculas da droga interagem com a ciclooxigenase-2 - uma enzima sintetizadora de prostaglandinas, inibindo sua atividade.
Isso impede a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina, preservando os níveis intracelulares de cAMP e aumentando a capacidade fagocítica dos macrófagos, facilitando a internalização dos fungos.
O fagossomo contendo fungos se funde com o lisossomo - uma organela ácida, formando um fagolisossomo com pH ácido e permitindo que o corante fluoresce.
As células tratadas com drogas exibem uma fluorescência mais alta do que as células não tratadas, sugerindo a eficácia da droga em aumentar a capacidade fagocítica dos macrófagos.
Comece com uma cultura da linhagem celular de macrófagos murinos, cultivada em meio RPMI 1640 completo, conforme descrito no protocolo de texto.
Além disso, prepare uma cultura de Cryptococcus neoformans ressuspensa em PBS até a concentração desejada, conforme mencionado no protocolo de texto.
Para corar as células criptocócicas com a coloração de fagocitose, dispense 999 microlitros das células em um tubo de microcentrífuga. Adicione 1 microlitro da mancha ao tubo. Incube as células por 1 hora em temperatura ambiente, no escuro, com agitação lenta.
Após a incubação, lavar as células por centrifugação primeira. Em seguida, descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células com PBS e repita a etapa de lavagem mais duas vezes.
Dispense 100 microlitros da suspensão celular de Cryptococcus neoformans nos poços da placa de 96 poços contendo os macrófagos cultivados.
Para estudar o efeito dos medicamentos de teste na fagocitose de macrófagos, dispense 100 microlitros do medicamento de teste desejado em poços apropriados da placa de 96 poços, conforme descrito no protocolo de texto.
Incube a placa em uma incubadora de dióxido de carbono por 2 a 6 horas. No final da incubação, medir a fluorescência da coloração fagocítica.