Detecção Bacteriana Quantitativa Multiplexada usando Microesferas Magnéticas Marcadas com Corante

0 views • 3:54 min • December 23rd, 2025

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Pegue uma placa de ensaio contendo uma mistura de microesferas de poliestireno magnético tingidas internamente com fluoróforos espectralmente diferentes.

Cada conjunto de microesferas é acoplado covalentemente a anticorpos de captura específicos de bactérias patogênicas distintas.

Adicione uma mistura bacteriana patogênica morta pelo calor. Incubar.

Os anticorpos de captura se ligam aos antígenos bacterianos alvo, formando complexos microesfera-bactéria.

Use um separador magnético para resolver complexos. Descarte as bactérias não ligadas e lave com tampão.

Adicione anticorpos tampão e de detecção biotinilados, que se ligam especificamente a bactérias ligadas à microesfera.

Separe magneticamente os complexos e lave com tampão.

Ressuspenda os complexos no buffer. Moléculas repórter de pipeta que compreendem estreptavidina acoplada a fluoróforo, que se ligam aos anticorpos de detecção biotinilados.

Separe e lave magneticamente os complexos. Ressuspenda no buffer.

Durante a análise baseada em fluxo, o primeiro laser excita os fluoróforos internos da microesfera, gerando assinaturas espectrais únicas e identificando conjuntos de microesferas únicos.

O segundo laser excita os repórteres de fluoróforos ligados a bactérias em microesferas, quantificando bactérias em vários conjuntos de microesferas, permitindo a detecção quantitativa de bactérias multiplexadas.

Para a captura de amostras, comece adicionando cinquenta microlitros de microesferas ou esferas conjugadas para capturar anticorpos em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione cinquenta microlitros das bactérias patogênicas seguidas por cinquenta microlitros de PBS-TBN nos poços de fundo.

Cubra a placa com um selo de placa de alumínio e incube em um agitador de placas a oitocentas rpm por uma hora.

Em seguida, coloque a placa no separador magnético por 1 minuto para separar as contas. Evacue a solução restante, mantendo a placa no separador magnético de placas. Em seguida, bata para secar em toalhas de papel de laboratório três a quatro vezes. Lave bem os poços com PBS-TBN duas vezes.

Para detecção de amostras, adicione cinquenta microlitros de tampão de ensaio seguido de cinquenta microlitros de anticorpo de detecção biotinilado a uma concentração de quatro microgramas por mililitro nos poços.

Incube a placa no escuro por uma hora para permitir uma interação eficiente entre bactérias e anticorpos de detecção. Em seguida, separe os grânulos usando o separador magnético e lave os grânulos com PBS-TBN, conforme demonstrado anteriormente.

Ressuspenda os grânulos em cinquenta microlitros de tampão de ensaio e adicione cinquenta microlitros de estreptavidina-R-ficoeritrina ou SAPE, uma molécula repórter fluorescente. Cubra a placa com um selo de alumínio e incube no agitador de placas por 30 minutos.

Depois que os poços forem lavados, ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de PBS-TBN e carregue a placa no analisador baseado em fluxo.

Registre as leituras usando o software apropriado. Os valores médios líquidos de intensidade de fluorescência para cada organismo podem ser avaliados por meio de uma curva padrão para determinar a carga bacteriana presente na amostra.

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Detecção de Patógenos alimentares bacterianas de Flies Individual Filth

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Last updated: 18 July 2026