Um procedimento de ponta STAGE para dessalinização e purificação de peptídeos

Pegue uma extração STop And Go ou STAGE Tip, uma coluna de purificação miniaturizada.

A ponta contém pequenas esferas de sílica ligadas a longas cadeias de hidrocarbonetos para purificação de peptídeos baseada em interação hidrofóbica.

Lavar com tampões contendo uma elevada percentagem de acetonitrila, removendo as impurezas da resina.

Introduza um tampão de ligação e uma centrífuga, equilibrando a coluna para uma ligação ideal de peptídeos.

Carregar uma amostra de peptídeo pré-digerida obtida a partir de células diferenciadas semelhantes a neutrófilos, contendo fragmentos de peptídeos e impurezas, incluindo sais.

Centrifugue para passar a amostra pela coluna. Os fragmentos de peptídeos se ligam às cadeias de hidrocarbonetos por meio de interações hidrofóbicas, enquanto os sais são removidos.

Adicione o tampão de ligação e centrifugue, removendo as impurezas restantes.

Introduza o tampão contendo alta acetonitrila para eluição.

Usando uma seringa, passe o tampão pela coluna. A acetonitrila se liga às cadeias de hidrocarbonetos, deslocando os fragmentos de peptídeos que eluem com o tampão.

Realize perfis proteômicos para identificar os peptídeos purificados.

Para começar, embale três camadas de resina C18 em uma ponteira de pipeta de 200 microlitros para construir uma ponteira STop And Go Extraction ou STAGE para cada amostra de peptídeo.

Pare a digestão enzimática das amostras de peptídeos previamente incubadas adicionando 1 por 10 volumes de solução de parada. Centrifugar as amostras a 13.200 rpm durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mililitros.

Em seguida, lave as pontas STAGE com 100 microlitros de acetonitrila 100% e centrifugue as pontas STAGE a 1000 g por 2 minutos ou até que todo o líquido passe pela resina C18.

Repita as lavagens da ponta STAGE com 50 microlitros de tampão B seguidos de 200 microlitros de tampão A com as mesmas condições de centrifugação.

Coloque as amostras nas pontas STAGE para centrifugar a 1000 g por 3 a 5 minutos. Em seguida, lave as pontas STAGE com 200 microlitros de tampão A por centrifugação a 1000 g por 3 a 5 minutos.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão B em cada ponta STAGE e, usando uma seringa, elua as amostras contendo tampão B em um tubo de PCR de 0,2 mililitro.

Uma vez que as amostras são eluídas, seque os peptídeos usando uma centrífuga a vácuo por 45 minutos. Execute as amostras em espectrometria de massa de alta resolução com as condições descritas no manuscrito do texto.

Para processar os dados para perfil proteômico, carregue os arquivos de dados brutos obtidos da espectrometria de massa no software MaxQuant. Consulte o manuscrito do texto para todos os parâmetros do software e seus ajustes.

Nos parâmetros globais, importe o arquivo FASTA do Homo sapiens para identificação de sequência baixado do banco de dados Uniprot registrando o ID do organismo, o número de proteínas e a data de download do arquivo.

Defina o número de núcleos do computador para processamento e selecione Iniciar. Após a conclusão do MaxQuant, uma pasta 'Combinada', juntamente com outros arquivos necessários para o upload para repositórios de dados, é gerada.

Para analisar os dados, carregue o 'proteingroups.txt' no Perseus e selecione todos os arquivos de quantificação sem rótulo ou intensidade LFQ para a janela 'Principal'. Filtre as linhas removendo contaminantes, peptídeos reversos e peptídeos identificados apenas pelo local e transforme os dados pelo log₂(x).

Para observar o número de proteínas detectadas em cada replicação, construa um diagrama numérico de Venn e defina anotações categoriais para cada amostra, fornecendo o mesmo nome para todas as réplicas de uma amostra biológica.

Filtre as linhas com base no valor válido com a proteína identificada em mais de 50% das réplicas e em pelo menos um grupo. Para substituir valores ausentes para LFQ, execute a imputação da distribuição normal.

Adicione informações de anotação baixadas do site da Perseus às linhas de proteínas, adicionando txt.gz arquivos FASTA nas pastas 'bin', 'conf' e 'annotation'. Traga termos específicos como nomes de proteínas, nomes de genes e ontologia de genes.

A matriz agora está completa e pode ser visualizada em ferramentas como gráficos de análise de componentes principais, mapas de calor e enriquecimento de categoria. Realize testes estatísticos para determinar mudanças significativas na abundância de proteínas entre as condições testadas.