Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:51 min. • July 8th, 2025
Comece com uma placa de vários poços revestida com uma vacina de teste e bloqueie locais de interação não específicos.
Adquira uma amostra de soro de um camundongo injetado com a vacina de teste.
Este soro contém anticorpos imunoglobulina G, ou IgG, que reconhecem a vacina de teste.
Aos poços revestidos com vacina, adicione amostras de soro diluídas em série.
Os IgGs se ligam à vacina. Lave para remover anticorpos não ligados.
Adicione anticorpos secundários conjugados com peroxidase que se ligam a IgGs. Remova os anticorpos secundários não ligados.
Adicione um substrato cromogênico. A peroxidase interage com o substrato, gerando um produto de cor azul.
Introduza um ácido para interromper a reação. A mudança no pH torna a solução amarela.
Usando um espectrofotômetro, meça a intensidade da cor de cada poço para determinar a concentração de IgG na amostra de soro.
Para o revestimento de antígeno do ensaio de imunoabsorção enzimática, ou placa ELISA, dilua o antígeno da proteína HI a 10 microgramas por mililitro com solução de revestimento e adicione 100 microlitros do antígeno diluído por poço na placa ELISA. Incube a placa a 4 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, lave a placa com 300 microlitros de PBST por poço.
Selar os poços com 300 microlitros da solução de vedação por poço por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, dilua três microlitros do soro de camundongos de cada grupo experimental 100 vezes, adicionando 297 microlitros de PBST e vortex o soro diluído. Adicione 100 microlitros de soro diluído por poço na placa ELISA revestida para cada amostra de soro. Da mesma forma, diluir os soros de controle positivo e negativo 100 vezes com PBST, adicionando 4 microlitros de soro de controle positivo ou negativo a 396 microlitros de PBST seguido de mistura de vórtice.
Para realizar a diluição de dupla proporção, adicione 200 microlitros do soro experimental previamente diluído à primeira fileira da placa ELISA revestida. Em seguida, adicione 100 microlitros de PBST a todos os poços, exceto aqueles nas linhas um e 12. Em seguida, ajuste a pistola de pipeta para 100 microlitros e transfira 100 microlitros de soro da primeira linha para a segunda linha contendo PBST.
Misture o conteúdo na segunda linha 10 vezes, usando a pistola de pipeta. Do mesmo modo, efectuar diluições sucessivas 1:2 do soro até à linha 11. Uma vez feito isso, descarte 100 microlitros de líquido da linha 11.
Adicionar 100 microlitros de soro negativo e positivo diluído a cada poço correspondente na linha 12, seguindo o modelo de amostra. Sele a placa ELISA com filme plástico e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto isso, dilua o anticorpo secundário anti-camundongo IgG HRP 10.000 vezes adicionando PBST. Após a incubação de uma hora, lave a placa ELISA com 300 microlitros de PBST por poço para limpar os anticorpos não ligados. Em seguida, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 40 minutos.
Lave a placa com 300 microlitros de PBST, por poço. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de revelação de cor TMB a cada poço. Coloque as placas a 37 graus Celsius e longe da luz por 10 minutos. Depois disso, termine a reação imediatamente com 50 microlitros de ácido sulfúrico 2 molar. Detecte a densidade óptica ou os valores de OD em 450 nanômetros, usando um marcador enzimático dentro de 15 minutos após o término.