JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Comece com células de mamíferos infectadas por vírus que produzem várias caspases, incluindo caspase-3.
Adicione um meio de crescimento ao poço de controle e um meio suplementado com inibidor de caspase-3 ao poço de teste.
No poço de controle, a caspase-3 reconhece e degrada as nucleoproteínas virais e as proteínas do hospedeiro essenciais para a propagação viral.
No poço de teste, o inibidor entra na célula, inibindo a atividade da caspase-3 e impedindo a degradação da proteína.
Desalojar as células da placa. Adicione um reagente de lise e aqueça para induzir a lise celular, liberando proteínas intracelulares.
Carregue ambas as amostras em um gel de poliacrilamida SDS e eletroforese para separar as proteínas com base no tamanho.
Após a eletroforese, transfira o gel para uma membrana de borrão.
Trate a membrana com anticorpos primários contra nucleoproteínas virais e proteínas do hospedeiro.
Lave e cubra com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo ligando-se a anticorpos primários, gerando bandas fluorescentes.
A fluorescência mais alta na amostra de teste indica clivagem viral e proteica do hospedeiro mediada pela caspase-3 reduzida em comparação com o controle.
Para começar, semeie células MDCK ou A549 em uma placa de cultura de células de 12 poços, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova o meio de cultura antigo das células e lave as células em cada poço duas vezes com 1 mililitro de MEM sem soro.
Em seguida, infecte as células adicionando 400 microlitros de inóculo do vírus influenza A e coloque a placa para incubação por uma hora. Após a incubação, remova o inóculo do vírus e lave as células com MEM. Adicione 1 mililitro de MEM sem soro a cada poço e incube as células conforme mostrado na etapa anterior.
Após 24 horas, colha as células raspando-as com um êmbolo de seringa de 1 mililitro e transfira-as para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 12.000 g durante dois minutos à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante. Lave o pellet celular com 250 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e centrifugue. Remova o sobrenadante e adicione 100 microlitros de tampão de lise celular. Misture por vórtice.
Aqueça o tubo a 98 graus Celsius por 10 minutos para lisar completamente as células. Em seguida, resolva quantidades iguais de proteína de amostras não infectadas e infectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS padrão. Após a eletroforese, transfira o gel de proteína para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF e execute o western blotting. Compare os níveis de proteína nas pistas de amostra infectadas tratadas com simulador e tratadas com inibidor.