Um ensaio para medir o acúmulo de uma sonda antibiótica fluorescente em células bacterianas

Pegue tubos de ensaio contendo amostras bacterianas.

Na amostra de teste, adicione moléculas inibidoras para bloquear a bomba de efluxo antibiótico da bactéria.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Adicione sondas antibióticas conjugadas com fluoróforo que entram nas células bacterianas.

Na amostra de controle, a bomba de efluxo extruda as sondas para o meio extracelular.

Na amostra tratada com inibidor, a bomba de efluxo bloqueada não pode expelir as sondas, causando seu acúmulo.

Centrifugue as amostras. Descarte o sobrenadante contendo sondas extracelulares.

Adicione tampão de lise seguido de lisozima para enfraquecer a parede celular bacteriana.

Execute ciclos de congelamento e descongelamento, sonicação e exposição a altas temperaturas para lisar as células.

centrifuga. Transferir o sobrenadante para uma membrana filtrante.

Lave e recolha o filtrado que contém as sondas.

Medir a intensidade de fluorescência do filtrado.

Uma maior intensidade de fluorescência em amostras bacterianas tratadas com inibidor sugere perda da função de efluxo, levando ao acúmulo de sonda intracelular.

Para análise de acúmulo de sonda, coloque os estoques de glicerol das cepas bacterianas em placas d