Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:02 min. • July 8th, 2025
Pegue tubos de ensaio contendo amostras bacterianas.
Na amostra de teste, adicione moléculas inibidoras para bloquear a bomba de efluxo antibiótico da bactéria.
Centrifugue e descarte o sobrenadante.
Adicione sondas antibióticas conjugadas com fluoróforo que entram nas células bacterianas.
Na amostra de controle, a bomba de efluxo extruda as sondas para o meio extracelular.
Na amostra tratada com inibidor, a bomba de efluxo bloqueada não pode expelir as sondas, causando seu acúmulo.
Centrifugue as amostras. Descarte o sobrenadante contendo sondas extracelulares.
Adicione tampão de lise seguido de lisozima para enfraquecer a parede celular bacteriana.
Execute ciclos de congelamento e descongelamento, sonicação e exposição a altas temperaturas para lisar as células.
centrifuga. Transferir o sobrenadante para uma membrana filtrante.
Lave e recolha o filtrado que contém as sondas.
Medir a intensidade de fluorescência do filtrado.
Uma maior intensidade de fluorescência em amostras bacterianas tratadas com inibidor sugere perda da função de efluxo, levando ao acúmulo de sonda intracelular.
Para análise de acúmulo de sonda, coloque os estoques de glicerol das cepas bacterianas em placas de ágar LB para uma incubação noturna a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, escolha uma única colônia do prato para cultura noturna em caldo de lisogenia a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, dilua a cultura durante a noite aproximadamente 50 vezes em meio fresco.
Quando a cultura atingir a fase intermediária, pulverize as bactérias por centrifugação e decanta o meio. Ressuspenda as bactérias em 1 mililitro de PBS e centrifugue as bactérias novamente. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet lavado em PBS a uma densidade óptica de 600 nanômetros de dois.
Adicione 10,1 microlitros de CCCP 10 milimolares em PBS a 1 mililitro de bactérias e incube as bactérias a 37 graus Celsius por 10 minutos. No final da incubação, colete as bactérias por centrifugação e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de solução antibiótica fluorescente micromolar de 10 a 100 em PBS.
Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, lave as células por centrifugação quatro vezes em 1 mililitro de PBS frio por lavagem. Após a lavagem, lise as bactérias com 180 microlitros de tampão de lise e 70 microlitros de lisozima.
Após 30 minutos a 37 graus Celsius, congele e descongele as bactérias três vezes a 78 graus Celsius negativos por 5 minutos e 34 graus Celsius por 15 minutos, respectivamente. Após a última rodada de congelamento e descongelamento, sonicar a amostra por 20 minutos, seguida de uma incubação de 30 minutos a 65 graus Celsius.
No final da incubação, recolher a amostra lisada por centrifugação e coar o conteúdo do tubo através de uma membrana filtrante de 10 kilodaltons. Lave o filtro quatro vezes com 100 microlitros de água por lavagem e alíquota de cada lavagem em poços individuais de uma placa preta de fundo plano de 96 poços. Em seguida, meça a intensidade de fluorescência em um leitor de placas com comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados ao fluoróforo.