Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:35 min. • July 8th, 2025
Comece injetando intraperitonealmente um glicolipídio sintético em um camundongo.
As células apresentadoras de antígenos, ou APCs, internalizam o glicolipídio e o apresentam por meio da molécula não clássica de MHC CD1d.
As APCs migram para o baço e interagem com as células T natural killer invariantes ou células iNKT, induzindo a ativação e proliferação de células iNKT.
Colha o baço. Dissocie-o mecanicamente para gerar uma suspensão unicelular.
Transfira as células para um tubo. Adicione um meio de gradiente de densidade e centrifugue para separar os linfócitos.
Colete os linfócitos. Adicione tetrâmeros CD1d marcados com fluoróforo carregados com antígeno glicolipídico que interagem com as células iNKT.
Remova os tetrâmeros não ligados. Sobreposição com microesferas magnéticas que se ligam aos fluoróforos ligados ao tetrâmero.
Remova os grânulos não encadernados e carregue a suspensão da célula em uma coluna magnética.
Sob o campo magnético, as células iNKT ligadas ao grânulo são retidas na coluna enquanto as células restantes fluem.
Remova a coluna do campo magnético. Adicione um tampão de eluição para eluir as células iNKT.
Injete DBA / 1 camundongo normal por via intraperitoneal com alfa-GalCer, na dosagem de 0,1 miligramas por quilograma de peso corporal. Três dias após a modelagem, após anestesia, isole o baço do camundongo. Prepare uma suspensão unicelular cortando e triturando o baço em uma peneira de 200 malhas. Lave a suspensão da célula com PBS. Centrifugue a 200 vezes g durante 5 minutos e elimine o sobrenadante.
Ressuspenda as células com 1 mililitro de sangue total e solução de diluição de tecido. Adicione 3 mililitros de meio de separação de linfócitos de camundongo e, em seguida, centrifugue as células por 20 minutos, a 300 vezes g, em temperatura ambiente.
Para purificar as células iNKT, ressuspenda 10 a 7 células com 100 microlitros de PBS de 4 graus Celsius. Adicione 10 microlitros de CD1d Tetramer-PE carregado com alfa-GalCer e incube-os a 4 graus Celsius por 15 minutos no escuro. Lave as células duas vezes com PBS e ressuspenda-as em 80 microlitros de PBS. Adicione 20 microlitros de microesferas anti-PE e incube-as a 4 graus Celsius por 20 minutos no escuro. Lave-os duas vezes com PBS e ressuspenda as células com 500 microlitros de PBS.
Coloque a coluna de classificação no campo magnético do classificador MACS e enxágue com 500 microlitros de PBS. Adicione a suspensão de células preparada à coluna de classificação, recolha o fluxo e enxágue três vezes com tampão PBS. Remova o campo magnético e adicione 1 mililitro de tampão PBS à coluna de classificação. Empurre rapidamente o êmbolo a uma pressão constante para conduzir as células marcadas para o tubo de coleta e obter as células iNKT purificadas. Conte com um contador de células automatizado.