Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:57 min. • July 8th, 2025
Comece com um tubo contendo mRNAs transcritos in vitro que codificam proteínas fluorescentes verdes.
O mRNA contém nucleotídeos modificados, trifosfato de 5-metilcitidina e trifosfato de pseudouridina, que previnem a resposta imune e aumentam a estabilidade do mRNA.
A extremidade 5' do mRNA é desfosforilada, impedindo seu reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões em macrófagos.
Adicione um reagente de transfecção à base de lipídios catiônicos ao mRNA, facilitando o encapsulamento do mRNA por meio de interações eletrostáticas e formando um complexo.
Introduza os complexos lipídico-mRNA em uma placa de vários poços com macrófagos primários derivados de camundongos aderidos e agite suavemente para uma mistura uniforme.
Os macrófagos internalizam o complexo contendo mRNA em um endossomo. Mais tarde, o complexo se funde com a membrana endossômica, liberando os mRNAs no citoplasma da célula.
A cauda poli-A na extremidade 3' estabiliza o mRNA que sofre síntese de proteínas para produzir proteínas fluorescentes verdes.
Sob um microscópio de fluorescência, a fluorescência verde dentro dos macrófagos sugere a transfecção bem-sucedida com mRNAs modificados.
Prepare-se para a transfecção adicionando o volume pré-calculado de tampão de transfecção de mRNA menos os volumes de reagente de transfecção de mRNA e o mRNA a um tubo de reação. Descongele o estoque de mRNA e misture-o delicadamente virando o tubo. Em seguida, adicione o volume pré-calculado de mRNA ao tubo de reação.
Vortex e gire para baixo a mistura de reação e o reagente de transfecção de mRNA, em seguida, adicione o volume apropriado do reagente de transfecção de mRNA ao tubo de mistura de reação. Vortex o tubo, gire-o para baixo e incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos. Enquanto isso, substitua o meio de cultura dos macrófagos por um meio de cultura fresco e quente.
Assim que a incubação da mistura de transfecção estiver completa, adicione a mistura aos poços da placa contendo os macrófagos gota a gota e em um círculo de fora para o meio do poço. Para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção, balance suavemente a placa na direção vertical e horizontal.
Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos seis horas. Após a incubação, analise a eficiência da transfecção com microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou immunoblot.
A parte mais importante deste procedimento é garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção para que todos os macrófagos entrem em contato com a mesma quantidade de mRNA.