Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:23 min. • July 8th, 2025
Comece com células do sangue do cordão umbilical humano, incluindo células-tronco hematopoiéticas CD34+, ou HSCs.
Adicione anticorpos para bloquear os receptores Fc celulares, impedindo a ligação não específica de esferas magnéticas específicas para HSC.
Introduzir as esferas magnéticas revestidas com anticorpos dirigidas às HSC CD34+. Centrifugar e rejeitar o sobrenadante.
Ressuspenda as células em um buffer. Passe-os por um separador magnético para reter HSCs ligados a contas; células não ligadas fluem.
Remova o campo magnético para coletar os HSCs.
Centrifugue e ressuspenda as células em um meio de crescimento. Coloque as células em placas e incuba.
O meio contém fatores de crescimento e citocinas que promovem a sobrevivência e expansão do HSC.
Colha as células. Adicione um meio de congelamento, transfira para um criogênico e congele.
Para gerar um sistema imunológico humano, ou HIS, modelo de camundongo, descongele os HSCs. Adicione-os a um meio pré-aquecido.
Centrifugue e ressuspenda as células em um tampão.
As células estão prontas para injeção em um filhote de camundongo imunodeficiente para a geração do modelo HIS.
Para começar, ressuspenda o pellet de células CD34-positivas isolado do sangue do cordão umbilical em 300 microlitros de tampão separador de células magnéticas por 1 x 108 células. Adicione 100 microlitros de reagente bloqueador de FcR por 1 x 108 células, seguido por 100 microlitros de esferas magnéticas CD34-positivas por 1 x 108 células e incube a 4 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, adicione 5 mililitros de tampão separador de célula magnética por 1 x 108 células e gire a 360 g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Repita a etapa de lavagem e ressuspenda o pellet em 500 microlitros por 100 milhões de células de tampão separador de célula magnética em um tubo cônico de 15 mililitros rotulado como 'não fracionado'. Rotule mais dois tubos de 15 mililitros - CD34-negativo e CD34-positivo. Coloque os três tubos em uma grade de resfriamento.
Separe as células usando o programa de seleção positiva de duas colunas em um separador magnético automático de células em um gabinete de biossegurança. Em seguida, para expandir e congelar células-tronco humanas CD34-positivas, prepare o sangue do cordão umbilical ou meio CB conforme descrito no manuscrito e passe por um filtro de 0,22 mícron. Ressuspenda as células CD34-positivas a 100.000 por mililitro de meio CB e incube a 37 graus Celsius.
No terceiro dia, adicionar ao balão um volume igual de meio CB sem citocinas. No quinto dia, colha as células CD34-positivas expandidas. Pipetar a suspensão celular para cima e para baixo e recolher num tubo cónico de 50 mililitros. Adicionar meio CB suficiente para cobrir o fundo do balão. Usando um raspador de células, raspe todo o fundo do frasco. Colete todos os meios no mesmo tubo de 50 mililitros e centrífugo.
Ressuspenda as células em 2 mililitros de meio CB e centrifugue. Aspirar o meio até ao pellet e ressuspender o pellet num meio de congelação. Em seguida, inicie a preparação de células CD34-positivas três horas após a irradiação do filhote. Aqueça 10 mililitros de mídia CB em um tubo de 50 mililitros.
Recupere um frasco de células CD34-positivas expandidas e congeladas in vitro para cada quatro a seis filhotes para injetar. Descongele rapidamente a 50 a 55 graus Celsius, até que apenas uma pequena quantidade de gelo seja visível, e adicione as células ao meio CB aquecido. Use 1 mililitro de meio para enxaguar cada frasco e gire as células a 360 g por 12 minutos a 4 graus Celsius.
Aspire o meio com cuidado. Ressuspenda o pellet em 2 mililitros de meio CB e conte as células. Novamente, centrifugue as células, aspire o meio e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS estéril por n mais 1 filhote para injetar, resultando em 250.000 a 450.000 células CD34-positivas por camundongo.