Inibição da autofagia baseada em siRNA em células dendríticas imaturas infectadas pelo vírus Herpes Simplex

Pegue duas cubetas de eletroporação. Uma cubeta contém um pequeno RNA interferente, ou siRNA, projetado para inibir a produção de FIP200, uma proteína indutora de autofagia.

A segunda cubeta contém um siRNA embaralhado como controle que não inibe a produção de FIP200.

Adicione células dendríticas imaturas, ou iDCs; eletroporar para a entrada celular de siRNA e, em seguida, plaquear as células.

O siRNA internalizado se liga a um complexo silenciador indutor de RNA.

O complexo com o siRNA específico para FIP200 cliva seu mRNA alvo, inibindo a produção de FIP200, enquanto os iDCs tratados com siRNA de controle produzem FIP200.

Colha as células e adicione o vírus herpes simplex. Após a fusão da membrana celular do envelope viral, o DNA liberado entra no núcleo e leva à produção de proteínas virais e nucleocapsídeos.

As proteínas virais interrompem as laminas nucleares. O FIP200 forma um complexo que desencadeia uma cascata de sinalização, induzindo a autofagia das laminas interrompidas para direcioná-las para degradação e facilitando o escape de nucleocapsídeos virais para o citoplasma.

A

inibição mediada por siRNA da produção de FIP200 restringe a autofagia da lamina, impedindo o escape do nucleocapsídeo.

As células estão prontas para avaliar a inibição da autofagia induzida por siRNA.

No dia 3.5 após a adesão, transfira 12 milhões de iDCs para um tubo de 50 mililitros. Centrifugue-os a 300 vezes g durante 5 minutos e depois elimine o sobrenadante. Paralelamente, realizar análises de citometria de fluxo para monitorar o status de maturação.

Lave suavemente os iDCs em 5 mililitros de OptiMEM sem vermelho de fenol e centrifugue-os a 300 vezes g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 microlitros de OptiMEM, ajustando a concentração celular para 6 milhões de células por 100 microlitros.

Adicione 75 picamoles de siRNA específico para FIP200 ou embaralhado a cubetas de eletrodos de 4 milímetros e transfira 100 microlitros da suspensão celular para a respectiva cubeta. Pulsar diretamente os iDCs usando um aparelho de eletroporação.

Após a eletroporação, transfira os iDCs para placas de seis poços com meio DC pré-aquecido fresco, semeando as células a uma concentração final de 1 milhão de células por mililitro e coloque-as na incubadora. Após 48 horas, examine microscopicamente a morfologia das iDCs eletroporadas, depois colha as células com um raspador de células e transfira-as para tubos de 15 mililitros.

Enxágue os poços com 1 mililitro de PBS suplementado com 0,01% de EDTA e transfira a solução para os respectivos tubos. Em seguida, divida as células para cada condição de siRNA conforme descrito no manuscrito.

Use 500.000 células para avaliar o estado de maturação e a viabilidade celular. Use 1 milhão de células para análise de western blot para verificar a eficiência de 200 knockdowns específicos e use as células restantes para experimentos de infecção por HSV-1.