JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:42 min • July 8th, 2025
Pegue vetores retrovirais misturados com células primárias do baço.
Os vetores contêm RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico ou CAR, que tem como alvo um antígeno específico do tumor.
A citocina interleucina-2 no meio promove seletivamente a proliferação de células T enquanto as outras células eventualmente morrem.
Transfira a mistura para uma microplaca revestida com fragmentos de fibronectina recombinante.
Centrifugue para facilitar a ligação dos fragmentos de fibronectina aos vetores e células T, mediando a interação vírus-célula hospedeira, e incubar.
Após a fusão do envelope dos vetores com a membrana celular, as enzimas virais transcrevem reversamente o RNA liberado em DNA e o incorporam ao genoma do hospedeiro.
As células T transduzidas expressam CARs ligados à superfície, consistindo em um fragmento variável de anticorpo extracelular direcionado ao antígeno específico do tumor e às regiões de sinalização intracelular para responder ao antígeno.
Ressuspenda as células antes de transferi-las para um tubo.
Centrifugue para descartar o sobrenadante contendo vírus não internalizados e ressuspenda as células em um tampão para ensaios a jusante.
No dia seguinte à esplenectomia, prepare PBS contendo 25 microgramas por mililitro de fragmento de fibronectina humana recombinante ou RHFF e cubra placas de 24 poços não tratadas com cultura de tecidos, adicionando 0,5 mililitros da solução a cada poço. No dia seguinte, remova a solução dos poços e adicione 1 mililitro por poço de 2% de BSA em PBS.
Incube em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, remova o BSA levantando firmemente a placa antes de adicionar 2 mililitros de PBS para lavar. Depois de coletar o sobrenadante viral das células HEK293T, adicione TCM fresco a um volume final em mililitros igual ao número de poços revestidos com RHFF mais 3 mililitros adicionais.
Remova os esplenócitos cultivados da incubadora e ressuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes em cada poço. Transferir as suspensões celulares para um tubo cónico de 50 mililitros. Em seguida, ressuspenda os esplenócitos no sobrenadante viral a 1 x 106 células por mililitro.
Em seguida, adicione 1 mililitro por alvéolo da suspensão de esplenócitos aos poços das placas revestidas com FFRH. Agora, gire as placas por 90 minutos a 32 graus Celsius e 770 gs com uma aceleração de 4 e uma configuração de quebra de zero. Durante a centrifugação, prepare 50 unidades internacionais por mililitro de IL-2 humana recombinante em MTC.
Após a centrifugação, adicione 1 mililitro do meio a cada poço das placas e incube durante a noite. Se as células T atingirem mais de 80% de confluência, divida as células pipetando suavemente para cima e para baixo em cada poço, duas a três vezes, e depois transfira 1 mililitro de cada poço para novos poços de uma placa nova tratada com cultura de tecidos de 24 poços.
Adicione 1 mililitro de TCM fresco, com 50 unidades internacionais por mililitro de IL-2 a cada poço. Se as células não atingirem mais de 80% de confluência, troque metade do meio pipetando lentamente 1 mililitro de meio do topo de cada poço e substituindo-o por 1 mililitro de TCM fresco, contendo 50 unidades internacionais por mililitro de IL-2 humana recombinante.
Ressuspenda as células CAR T pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes em cada poço e transfira para um tubo de centrífuga de 250 mililitros. Gire as células a 300 gs por 10 minutos. Em seguida, aspirar completamente o sobrenadante sem perturbar o projétil. Use PBS para lavar as células e conte-as antes de lavar uma segunda vez. Um rendimento típico de células T CAR é de aproximadamente 1 x 106 células por poço.