Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:55 min. • July 8th, 2025
Comece com uma suspensão de células T e trate-as com lentivírus CAR carregando um gene para o receptor de antígeno quimérico ou lentivírus CAR e CRISPR.
O lentivírus CRISPR contém genes para o RNA guia e a nuclease Cas9, bem como um gene de resistência a antibióticos.
Os lentivírus CAR e CRISPR interagem com as células T e liberam seu RNA.
Esses RNAs são transcritos reversamente e convertidos em DNA correspondente, que se integra ao DNA das células T.
Isso permite a síntese de proteínas CAR, RNAs guia e proteínas Cas9.
O RNA guia forma um complexo com Cas9, que reconhece e se liga especificamente ao gene alvo no DNA das células T.
Enquanto isso, Cas9 cliva o DNA, criando uma quebra de fita dupla.
Essa quebra é reparada por meio de junção de extremidade não homóloga, um mecanismo de reparo propenso a erros, resultando na modificação do gene alvo.
Isso gera células T geneticamente modificadas com receptores de antígenos quiméricos.
Trate as células com antibióticos para eliminar as células T não modificadas e isole seletivamente as células T CAR geneticamente modificadas.
Para interromper o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, utilize um RNA guia, conforme descrito no manuscrito. Incube os reagentes de transfecção em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, adicione-as às células 293T que atingiram 70% a 90% de confluência e cultive as células transfectadas a 37 graus Celsius, 5% de CO2 para produzir lentivírus.
Às 24 e 48 horas, colha e concentre o sobrenadante contendo vírus por ultracentrifugação em tubos de ultracentrífuga de 50 mililitros e congele a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Então, no primeiro dia, ressuspenda suavemente as células T para quebrar as rosetas.
Em um laboratório aprovado para BSL-2 plus, para gerar células T CAR, adicione lentivírus CAR19 e lentivírus CRISPR direcionado a GM-CSF às células T estimuladas. No terceiro e quinto dia, para células T editadas por lenti-CRISPR transduzidas com sucesso com resistência à puromicina, trate as células com dicloridrato de puromicina a uma concentração de 1 micrograma de puromicina por mililitro.