Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

Pegue as células T suspensas em um meio adequado para eletroporação, um processo no qual pulsos elétricos criam poros temporários na membrana celular.

Adicione complexos contendo uma proteína Cas9 e um único RNA guia ou sgRNA. SGRNA É um pequeno RNA que direciona Cas9, uma tesoura molecular, para um local específico no DNA para corte.

Adicione moléculas curtas de DNA de fita simples que auxiliam no transporte dos complexos Cas9-sgRNA para dentro da célula.

Transfira esta mistura para uma cubeta e inicie a eletroporação aplicando breves pulsos elétricos.

Esse processo permite que os complexos entrem na célula.

O sgRNA se liga ao local alvo no DNA da célula T, permitindo que Cas9 edite o DNA, criando uma quebra em ambas as fitas.

Essa interrupção sinaliza as proteínas de reparo para o local.

As proteínas de reparo então reconectam as extremidades, tornando o gene não funcional.

Incubar as células T editadas por genes em um meio adequado para ensaios a jusante.

Prepare a ribonucleoproteína, ou complexo RNP, incubando 10 microgramas de nuclease Cas9 com 5 microgramas de RNA guia único por 10 minutos em temperatura ambiente. Inclua um controle simulado sem RNA guia único. Combine as cél