Gerando um modelo de camundongo BLT (medula óssea, fígado, timo) duplamente humanizado

Comece com um camundongo anestesiado e imunodeficiente que não possui células imunológicas.

Trate o camundongo com uma dose subletal de raios-X para eliminar as células-tronco existentes da medula óssea.

Disseque o camundongo e entregue fragmentos de fígado fetal humano e tecido timo entre o rim e sua cápsula.

Feche a incisão.

O fígado implantado e o tecido do timo crescem, formando organoides, que são agregados celulares que se assemelham a um órgão.

Após a recuperação, injete células-tronco hematopoiéticas humanas ou HSCs na veia da cauda.

As HSCs injetadas migram para o organoide do timo e a medula óssea, diferenciando-se em várias células imunológicas humanas.

Forneça água suplementada com antibióticos ao camundongo para matar os micróbios intestinais existentes.

Usando um tubo oral, introduza micróbios fecais humanos diretamente no intestino do camundongo para promover a colonização microbiana.

Isso resulta no desenvolvimento de um modelo de camundongo BLT duplamente humanizado com um sistema imunológico humano e micróbios intestinais.

Para implantar os tecidos do fígado e do timo na cápsula do rim esquerdo, primeiro coloque o camundongo em um capuz. No dia da cirurgia, trate os camundongos com irradiação subletal de corpo inteiro a uma dose de 12 centi-gray por grama de peso corporal. Raspe cada mouse ao redor do lado lateral esquerdo e medial depois de confirmar um nível apropriado de sedação. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal, aplique uma marca auricular conforme necessário e desinfete a pele com três esfoliantes sequenciais de iodo e isopropanol 70%.

Quando a pele estiver preparada, use uma pinça para carregar um fragmento de tecido hepático fetal humano cúbico de 1 a 1,6 milímetro em um trocarte, seguido por um fragmento de tecido do timo fetal humano cúbico de 1 a 1,6 milímetro. Use a pinça para levantar a pele e use um bisturi para fazer um pequeno corte longitudinal na pele. Estenda o corte para 1,5 a 2 centímetros no lado esquerdo do mouse e use uma pinça para levantar a camada muscular. Use uma tesoura para abrir a camada muscular longitudinalmente, estendendo o corte conforme necessário, para expor o rim e segure suavemente o tecido adiposo ao redor do rim.

Use um bisturi para fazer uma incisão de 1 a 2 milímetros na extremidade posterior da cápsula renal e insira lentamente o trocarte pré-carregado na incisão, paralelo ao eixo longo do rim. Libere os tecidos entre a cápsula renal e o rim e retorne o rim e o intestino às suas posições normais. Em seguida, use suturas para fechar a camada muscular e grampos cirúrgicos para fechar a pele. Coloque o mouse em uma gaiola de micro-isolador autoclavada com monitoramento até a decúbito total. Seis horas após a cirurgia, coloque os camundongos sob uma lâmpada de calor e desinfete os ratos com isopropanol a 70%.

Injete 1,5 a 5 x 10⁵ células-tronco hematopoiéticas isoladas de tecido hepático fetal humano CD34-positivo em 200 microlitros de PBS em uma veia da cauda dilatada por animal. Em seguida, pare qualquer sangramento com uma leve pressão e devolva os ratos à gaiola de origem. 9 a 12 semanas após a cirurgia, use uma contenção de cone de plástico de tamanho apropriado para isolar uma perna de um camundongo humanizado e borrife o lado medial da perna isolada com 70% de isopropanol. Espalhe antibiótico e pomada para aliviar a dor no local da coleta.

Usando uma agulha de calibre 25 mantida em um ângulo de 90 graus, perfure a veia safena para coletar 50 a 100 microlitros de sangue em um tubo de coleta de sangue revestido com EDTA. Quando um volume adequado de sangue for obtido, aplique pressão no local com o pedaço estéril de gaze para parar o sangramento antes de retornar o camundongo à sua gaiola. Em seguida, use a amostra de sangue periférico coletada para avaliar o nível de reconstituição de células imunes humanas por citometria de fluxo, usando anticorpos contra CD45 humano, CD3, CD4, CD8, CD19 e CD45 de camundongo.

Para a coleta de amostras fecais frescas, coloque sacos de papel autoclavados individuais em uma capela e coloque um rato em cada saco até que cada animal defece. Em seguida, devolva os camundongos à gaiola e use uma pinça estéril para transferir cada amostra fecal para um tubo de 1,5 mililitro por camundongo para armazenamento de 80 graus Celsius negativos.

No final do tratamento com antibióticos de 14 dias, troque a água potável por água esterilizada autoclavada e transfira os camundongos para uma nova gaiola autoclavada. 24 e 48 horas após a interrupção dos antibióticos, encha as fontes devidamente preparadas de material de transplante de microbiota fecal e alíquota as amostras em uma câmara anaeróbica em condições anaeróbicas.

Para realizar um transplante fecal, entregue 200 microlitros de material de transplante de microbiota fecal por gavagem oral a cada animal experimental e espalhe qualquer material descongelado restante no pelo dos camundongos humanizados ou na cama da gaiola.