Gerando uma vacina de vesícula de membrana externa de exibição multivalente

Pegue os poliplexos de transfecção contendo plasmídeos alvo ligados a um polímero. Os plasmídeos codificam um antígeno viral fundido a uma etiqueta de peptídeo e uma marca de afinidade.

Incube os poliplexos com células de mamíferos, que internalizam os poliplexos dentro dos endossomos.

O polímero induz a ruptura da vesícula. Os plasmídeos liberados expressam o antígeno viral, que é secretado extracelularmente.

Colha o sobrenadante que contém o antígeno e os contaminantes. Adicione um agente concorrente em baixa concentração.

Carregue-o em uma coluna de cromatografia de afinidade.

As marcas de afinidade se ligam à resina da coluna, imobilizando o antígeno, enquanto o agente concorrente diminui a ligação não específica.

Flua o agente concorrente em baixa concentração, removendo contaminantes fracamente ligados.

Lave com concentrações crescentes de agentes concorrentes para deslocar os antígenos fortemente ligados, eluíndo-os.

Introduza vesículas bacterianas da membrana externa, ou OMVs, com uma proteína de captura ligada à superfície e incuba.

As etiquetas de peptídeos de antígeno se ligam às proteínas capturadoras, formando uma vacina OMV com uma exibição de antígeno multivalente.

Execute a purificação do OMV SpyCatcher. Comece centrifugando a solução bacteriana. Filtrar o sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 micrómetros e, em seguida, concentrar-se com uma coluna de fibras ocas. Filtrar o concentrado através de um filtro de membrana de 0,22 micrómetros, centrifugá-lo a 150 000 vezes g a 4 graus Celsius durante duas horas com uma ultracentrífuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspenda a precipitação com PBS e armazene-a a 80 graus Celsius negativos.

Para realizar a transfecção RBD-SpyTag, comece selecionando um sistema de expressão eucariótico apropriado e cultive as células durante a noite a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius após a recuperação. Adicione 20 microlitros HEK293F de solução celular ao contador de células automatizado. Registre o número de células. Ajuste a concentração para 1 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro e, em seguida, cultive as células a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius por 4 horas.

Filtre o plasmídeo RBD-SpyTag através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetro e adicione 300 microgramas de plasmídeos ao meio de cultura de células até que o volume final seja de 10 mililitros. Agite por 10 segundos. Aqueça o PEI a 65 graus Celsius no banho-maria. Misture 0,7 mililitros de PEI com 9,3 mililitros de meio de cultura de células e agite intermitentemente por 10 segundos.

Adicionar solução de plasmídeo à solução de PEI. Agite a mistura intermitentemente por 10 segundos e incube-a a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione a mistura a 280 mililitros de meio de cultura de células e cultive a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius por 5 dias.

Em seguida, execute a purificação do RBD-SpyTag. Comece centrifugando as células a 6.000 vezes g a 25 graus Celsius por 20 minutos. e use uma pipeta para coletar o sobrenadante. Construa a coluna com 2 mililitros de agarose níquel-NTA e lave três vezes com PBS.

Adicione imidazol ao sobrenadante celular para fazer a concentração final de 20 milimolares e carregue o sobrenadante celular. Adicionar 3 volumes de coluna de PBS contendo 20 milimolares de imidazol para lavagem e recolher a fracção de lavagem. Eluição gradiente com três volumes de coluna de PBS contendo concentrações baixas a altas de imidazol. Eluir duas vezes para cada concentração.

Para determinar a concentração de proteína pelo método BCA, dilua em série a solução de proteína BSA padrão de 2 a 0,0625 miligramas por mililitro. Dilua o OMV SpyCatcher e o RBD-SpyTag purificados 10 vezes. Em seguida, misture as soluções de trabalho BCA A e B na proporção de 50 para 1. Adicione a solução de proteína diluída e misture com a solução de trabalho BCA. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Meça a absorbância a 562 nanômetros de cada poço e calcule a concentração de proteína a partir da curva padrão.

Para realizar a bioconjugação de OMV SpyCatcher e RBD-SpyTag, misture OMV SpyCatcher em RBD-SpyTag em PBS na proporção de 40 para 1. Gire verticalmente para misturar a mistura durante a noite a 15 rotações por minuto a 4 graus Celsius. Realize a purificação do OMV RBD usando a solução PBS usando um procedimento semelhante à purificação do OMV SpyCatcher.