Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:22 min. • July 8th, 2025
Pegue uma mistura de um RNA CRISPR, ou crRNA, e um crRNA ou tracrRNA transativador.
Aqueça a mistura e deixe esfriar, facilitando o emparelhamento de bases do tracrRNA com o crRNA para formar um RNA guia, ou gRNA.
Adicione tesouras moleculares chamadas enzimas Cas9 que se ligam ao gRNA, criando complexos.
Adicione os complexos Cas9-gRNA às células Natural Killer ou NK suspensas em uma solução de eletroporação.
Introduzir moléculas de DNA de fita simples que auxiliam no transporte de complexos Cas9-gRNA.
Transfira a mistura para uma cubeta e realize a eletroporação, criando poros temporários na membrana para que os complexos entrem na célula.
O gRNA se liga ao local alvo no genoma, permitindo que Cas9 clive o DNA.
As proteínas de reparo se ligam no local da quebra e se unem ao DNA, muitas vezes causando erros de inserção ou deleção do par de bases. A modificação resultante interrompe o gene alvo, tornando-o não funcional.
Transferir as células geneticamente modificadas para um meio adequado para análise posterior.
No dia da eletroporação, encher um frasco T25 com 8 mililitros de meio de cultura fresco suplementado com 100 UI por mililitro de IL-2 por condição celular experimental e
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