JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:22 min • July 8th, 2025
Pegue uma mistura de um RNA CRISPR, ou crRNA, e um crRNA ou tracrRNA transativador.
Aqueça a mistura e deixe esfriar, facilitando o emparelhamento de bases do tracrRNA com o crRNA para formar um RNA guia, ou gRNA.
Adicione tesouras moleculares chamadas enzimas Cas9 que se ligam ao gRNA, criando complexos.
Adicione os complexos Cas9-gRNA às células Natural Killer ou NK suspensas em uma solução de eletroporação.
Introduzir moléculas de DNA de fita simples que auxiliam no transporte de complexos Cas9-gRNA.
Transfira a mistura para uma cubeta e realize a eletroporação, criando poros temporários na membrana para que os complexos entrem na célula.
O gRNA se liga ao local alvo no genoma, permitindo que Cas9 clive o DNA.
As proteínas de reparo se ligam no local da quebra e se unem ao DNA, muitas vezes causando erros de inserção ou deleção do par de bases. A modificação resultante interrompe o gene alvo, tornando-o não funcional.
Transferir as células geneticamente modificadas para um meio adequado para análise posterior.
No dia da eletroporação, encher um frasco T25 com 8 mililitros de meio de cultura fresco suplementado com 100 UI por mililitro de IL-2 por condição celular experimental e colocar os frascos em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius e 5% de CO2.
Enquanto o meio está se equilibrando, adicione 3 a 4 x 106 células por condição, por 26 microlitros de mistura de transdução em um tubo cônico e pellet as células por centrifugação. Em seguida, lave as células três vezes em 12 mililitros de PBS estéril por lavagem para remover todo o FBS das suspensões celulares.
Enquanto as células estão sendo lavadas, ressuspenda cada RNA CRISPR e RNA traçador para 200 concentrações finais micromolares. Misture 2,2 microlitros de cada RNA CRISPR com um volume de 200 micromolares de RNA traçador por amostra e aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente e armazene os complexos de RNA traçador CRISPR a 20 graus Celsius negativos até seu uso.
Para formar os complexos de ribonucleoproteínas, adicione a endonuclease Cas9 ao complexo de RNA CRISPR correspondente apropriado - RNA traçador com turbilhão de 30 a 60 segundos e incube os complexos de ribonucleoproteína Cas9 resultantes à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos.
Após a última lavagem, adicione todo o volume de suplemento de eletroporação do kit Nucleofector solução P3 e ressuspenda cada pellet celular em 20 microlitros da solução primária P3 4D-Nucleofector
Adicione imediatamente 5 microlitros de cada complexo de ribonucleoproteína à suspensão celular apropriada e adicione 1 microlitro de 100 potenciadores de eletroporação Cas9 micromolares à mistura de células do complexo de ribonucleoproteína Cas9. Transfira 26 microlitros da solução de células de ribonucleoproteína Cas9 para poços individuais de uma tira de nucleocuvete e bata suavemente na tira para garantir que as amostras cubram o fundo de cada poço.
Em seguida, inicie o programa do sistema 4D-Nucleofector EN-138. No final da transdução, deixe as células descansarem por três minutos. Em seguida, adicione 80 microlitros do meio de cultura pré-equilibrado a cada cubeta e transfira suavemente as amostras para um frasco por condição a 37 graus Celsius de incubação.