JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Comece com plasmídeos bidirecionais que transportam cDNA que codificam certas proteínas essenciais virais de uma cepa de influenza adaptada ao frio.
Introduzir um novo conjunto de plasmídeos bidirecionais contendo hemaglutinina e cDNA de neuraminidase modificado de uma cepa diferente de influenza.
Introduza um reagente de transfecção a esta mistura e incube para formar um complexo com os plasmídeos.
Transfira esses complexos para células epiteliais humanas cultivadas para permitir a entrada do plasmídeo na célula.
Os plasmídeos bidirecionais com dois promotores em orientações opostas permitem a produção de proteínas virais e seu RNA correspondente.
Incube as células a uma temperatura mais baixa.
As proteínas virais e os RNAs virais se auto-montam para formar vírus influenza recombinantes adaptados ao frio com replicação reduzida em condições mais quentes.
Sobreposição com células MDCK com superexpressão de ácido siálico e enzimas tripsina modificadas que permitem a ligação viral e a entrada dentro das células.
Incubar na mesma temperatura para induzir a replicação e produção de novos vírus.
Centrifugar e colher os vírus vivos atenuados recombinantes da gripe, prontos para uma preparação de vacina.
Para começar, coloque um milhão de células 293T em cada poço de uma placa de 6 poços com DMEM contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de estreptococos em caneta. Em seguida, prepare uma mistura de transfecção de plasmídeo suficiente para 100 microlitros por poço. Combinar um micrograma de cada plasmídeo e encher o tubo com um meio celular Opti-MEM pré-aquecido até 50 microlitros. Em outro tubo, adicione o dobro do volume de lipofectamina 2000 correspondente à quantidade total de plasmídeo a ser transfectado e complete o tubo para 50 microlitros com Opti-MEM.
Antes de adicionar a mistura de transfecção às células, deixe descansar por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros da mistura de transfecção a cada poço e mova a placa para uma incubadora por 16 horas. No dia seguinte, troque o meio para DMEM com 0,3% de BSA e 1% de estreptococos de caneta. Então. mova as células para 33 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco horas.
Após cinco horas, adicione uma sobreposição de um milhão de células MDCK permissivas à influenza em DMEM suplementado com tripsina. Manter as coculturas por 2 a 3 dias sob o regime de incubação de 33 graus Celsius para gerar e amplificar o vírus. Mais tarde, limpe os detritos usando uma centrifugação de cinco minutos de 260 g e, em seguida, colete os sobrenadantes.