JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:55 min • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo células natural killer, ou NK, e células cancerígenas. Os poços de controle contêm apenas células cancerígenas.
Centrifugue para facilitar o contato celular.
incubar. Os receptores ativadores nas células NK se ligam aos ligantes da superfície das células cancerígenas, fazendo com que as células NK liberem grânulos contendo moléculas citotóxicas.
Essas moléculas criam poros da membrana celular cancerígena e induzem a apoptose liberando conteúdo intracelular, incluindo lactato desidrogenase, ou LDH.
Adicione um detergente para lisar as células cancerígenas nos poços de controle para liberação máxima de LDH.
Centrifugue e transfira uma porção de sobrenadantes contendo LDH para uma placa de ensaio.
Adicione o reagente de ensaio e incube.
O LDH converte lactato em piruvato, reduzindo o NAD+. A diaforase usa NADH para reduzir o sal de tetrazólio, formando um produto formazan de cor vermelha.
Adicione uma solução ácida para interromper a reação enzimática.
Use um leitor de microplacas para medir a absorbância de formazan nos poços.
A intensidade do formazan é proporcional ao número de células cancerígenas lisadas no poço de teste, indicando citotoxicidade das células NK contra células cancerígenas.
Primeiro, obtenha uma placa de 96 poços tratada com cultura de fundo redondo e configure-a conforme descrito na tabela 1 do protocolo de texto. Centrifugue a placa de doseamento a 250 vezes g durante 4 minutos para se certificar de que o efetor e as células-alvo estão em contacto. Em seguida, incube a placa em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 5 horas.
45 minutos antes da colheita dos sobrenadantes, adicione 10 microlitros de solução de lise 10x aos poços de liberação máxima de LDH da célula-alvo e retorne a placa à câmara umidificada. Quando a incubação estiver concluída, centrifugue a placa a 250 vezes g por 4 minutos. Em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir alíquotas de 50 microlitros de cada poço para uma nova placa de ensaio de fundo plano de 96 poços.
Adicione 50 microlitros de reagente de ensaio a cada poço da placa de ensaio. Cubra o prato com papel alumínio para protegê-lo da luz e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, adicione 50 microlitros de solução de parada a cada poço. Certifique-se de ler a placa dentro de 1 hora após adicionar a solução de parada e registre a absorbância em 490 nanômetros.