Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:32 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante e adicione células T CD8-positivas murinas ativadas.
Introduzir vetores retrovirais contendo um RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico ou CAR.
Cubra a placa e feche-a em um saco para evitar contaminação. Centrifugue a placa em baixa velocidade para facilitar a interação vírus-célula.
A fibronectina se liga ao vírus e à célula, colocalizando-os para aumentar a transferência de genes mediada por vírus.
Pós-centrifugação, remova o saco selado e incube a placa em condições fisiológicas.
O envelope do vetor viral se funde com a membrana celular, liberando o RNA viral e as enzimas.
As enzimas virais transcrevem reversamente o RNA liberado e integram o DNA resultante no genoma do hospedeiro, permitindo que as células expressem CARs ligados à superfície.
O CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno específico para o antígeno alvo e domínios de sinalização para ativação de células T.
As células T CAR específicas do antígeno estão prontas para ensaios a jusante.
No dia 1, prepare placas revestidas com fragmentos de fibronectina humana adicionando 0,5 mililitros de fibronectina aos poços de uma placa de 24 poços e incubando-a durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, remova a solução de fibronectina e adicione 1 mililitro de BSA a 2% em PBS por poço. Incube a placa em temperatura ambiente por 30 minutos e lave os poços tratados com 1 mililitro de PBS estéril. A placa está pronta para uso após a remoção da solução de lavagem.
Conte as células T CD8 ativadas usando azul de tripano. Colete-os por centrifugação e ressuspenda-os a 5 milhões de células viáveis por mililitro para transdução. Adicione 100 microlitros da suspensão de células CD8 ativadas a cada poço da placa revestida com fibronectina. Em seguida, adicione 1,5 a 2 mililitros do meio contendo vírus previamente preparado e misture usando um movimento giratório para dispensar uniformemente as células.
Feche a placa num saco zip-lock e centrifugue-a a 2000 vezes g durante 90 minutos a 37 graus Celsius. Retire a placa da centrífuga e leve-a a um armário de segurança biológica. Remova cuidadosamente o saco plástico e certifique-se de que a parte externa da placa não esteja contaminada com meio. Transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.
Após 4 horas, remova 1 mililitro de meio de cada poço. Substitua-o por 1 mililitro de meio de células T completo pré-aquecido e coloque a placa de volta na incubadora.