Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:43 min. • July 8th, 2025
Comece com uma solução de polímero congelado contendo polímeros carregados positivamente.
Descongele a solução de polímero até atingir a temperatura ambiente.
Adicione um tampão e um vórtice para uma mistura uniforme, gerando uma solução homogênea.
Introduza o mRNA alvo na solução de polímero em uma proporção igual para uma reação ideal.
Incubar para permitir que os polímeros carregados positivamente interajam com os grupos fosfato carregados negativamente no mRNA por meio de interações eletrostáticas.
Isso facilita a incorporação do mRNA dentro da estrutura do polímero, formando nanopartículas de complexos mRNA-polímero ou poliplexos.
Transfira esses poliplexos para um tubo contendo água livre de RNase.
Misture-os e deixe a precipitação dos poliplexos.
Introduza um tampão contendo sacarose e congele-o. A sacarose atua como um crioprotetor que mantém a integridade estrutural dos poliplexos.
Em seguida, execute a liofilização para remover quaisquer vestígios de água.
Armazene-o em baixa temperatura como candidato a vacina de mRNA para uso futuro.
Para a formação de poliplexos, descongele os polímeros previamente preparados C-6 peptídeo poli-beta amino ésteres e vortex a solução. Depois de pipetar a mistura de polímero para cima e para baixo, prepare uma solução de 12,5 milimolares em acetato de sódio. Vortex a solução e aguarde 10 minutos.
Em seguida, prepare o mRNA a 0,5 miligramas por mililitro e misture pipetando. Vortex a solução de polímero novamente. Em seguida, misture a solução de material genético na solução de polímero na proporção de um para um em um tubo de microcentrífuga e incube o tubo a 25 graus Celsius por 30 minutos em um bloco térmico. Após a incubação, precipitar a mistura com uma a duas águas isentas de RNase, adicionando a amostra a um tubo de microcentrífuga contendo a água.
Em seguida, para incluir os excipientes, adicione HEPES 20 milimolares e solução de sacarose a 4% no mesmo volume da mistura de mRNA e ésteres de aminoácidos poli-beta e misture por pipetagem. Para liofilização, após congelar a solução poliplex a 80 graus Celsius negativos por uma hora, execute a secagem primária e, em seguida, armazene imediatamente os poliplexos a 20 graus Celsius negativos para evitar a reidratação.