Construindo um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada contra o HIV

Prepare um camundongo receptor gravemente imunocomprometido anestesiado.

Faça uma incisão para expor o rim e criar um orifício na cápsula renal.

Pegue uma agulha de implante contendo tecido de timo fetal humano e células derivadas do fígado fetal suspensas em uma mistura de proteínas gelatinosas.

As células incluem células-tronco hematopoiéticas modificadas, ou HSCs, expressando receptores de antígenos quiméricos, ou CARs, direcionados contra o HIV.

Implante a suspensão celular e o tecido timo sob a cápsula e, em seguida, feche a incisão.

Em seguida, injete retroorbitalmente os HSCs que expressam CAR e permita que o camundongo se recupere.

No rim, a mistura de proteínas gelatinosas polimeriza em uma matriz, retendo as HSCs no local de implantação.

As HSCs da matriz migram para o timo, diferenciando-se em células T humanas funcionais.

Enquanto isso, as HSCs injetadas retroorbitalmente atingem a medula óssea e se diferenciam em células B humanas funcionais, monócitos e células NK.

O modelo de camundongo com sistema imunológico humano contra o HIV já está pronto.

Despeje os pedaços de timo e o meio do frasco em um prato de 60 milímetros. Resfrie algumas pontas de pipeta de deslocamento positivo colocando-as em tubos abertos com tampa de rosca estéril de 1,5 mililitro no gelo. Além disso, coloque os pellets de células e um volume de mistura de proteínas gelatinosas, como Matrigel, no gelo.

Anestesie os camundongos receptores com um anestésico injetável de acordo com um protocolo animal aprovado. Verifique o nível de anestesia do mouse apertando uma pata. A ausência de reação ao pinçamento indica um plano cirúrgico de anestesia.

Raspe o lado esquerdo de cada rato do quadril ao ombro, entre o centro das costas e o estômago. Por via subcutânea, injete 6 miligramas por quilograma de carprofeno diluído no ombro ou triângulo inguinal do animal. Lave a cânula do trocarte com PBS em um prato de 60 milímetros. Usando uma pinça curva e romba, coloque um pedaço de timo do prato de 60 milímetros dentro da abertura da cânula e, em seguida, puxe o trocarte para aspirar o tecido para dentro da cânula.

Em seguida, use uma pipeta de deslocamento positivo e uma ponta gelada para adicionar 5 microlitros de mistura de proteína gelatinosa fria no tubo com o pellet celular e mexa suavemente para gerar a suspensão celular. Pipete a suspensão celular na abertura da cânula e puxe lentamente o trocarte para carregar a agulha.

Limpe a área raspada do camundongo com iodopovidona seguido de isopropanol três vezes. Determine o ponto mais escuro sob a pele, que indica a localização do baço. O rim é aproximadamente 5 milímetros dorsal ao baço.

Depois de garantir um nível adequado de anestesia pela ausência de reação ao beliscão da pata, use uma pinça curva para levantar a pele e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de 15 milímetros na pele paralela ao baço. Em seguida, faça um corte semelhante na camada de peritônio abaixo.

Nos machos, o rim é facilmente visível, portanto, extrudado simplesmente pressionando o abdômen. Apoie o rim com um hemostático ou um par de pinças curvas rombas. Nas mulheres, os ovários tendem a bloquear o rim de fácil extração. Usando um hemostático, pegue o ovário e exponha cuidadosamente o rim.

Use uma pinça com ponta de agulha para arrancar um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal. Deslize o trocarte neste orifício e ao longo do rim até que a abertura da cânula esteja completamente coberta pela cápsula renal. Expulse suavemente o tecido sob a cápsula renal e puxe o trocarte de volta para fora. Use uma pinça curva para garantir que o pedaço de timo não saia com a agulha.

Em seguida, levante o peritônio com a pinça e use suavemente o hemostático para empurrar o rim de volta ao lugar. Amarre um ponto de nó duplo com sutura cirúrgica no peritônio. Além disso, coloque dois clipes automáticos para fechar a pele.

Agora, misture as células CD34-positivas transduzidas e aspire 0,5 x 10⁶ células em um volume de 100 microlitros em uma seringa de insulina. Injete essas células no camundongo por meio de injeção de veia retro-orbital.

Após a injeção, esfregue uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho e coloque o mouse de lado em uma gaiola. Depois de implantar todos os camundongos, confirme se os animais recuperaram a consciência e estão ambulatoriais antes de devolvê-los ao alojamento.