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Comece com uma cultura de células-tronco da medula óssea.
Introduza o tampão tripsina-EDTA para separar as células e quebrar os aglomerados celulares, formando uma suspensão unicelular.
Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com um meio fresco.
Transfira a suspensão para uma seringa e conecte-a a uma unidade de filtro de membrana.
Empurrar o êmbolo e rejeitar o meio que contém o filtrado.
Retire o filtro. Encha a seringa com um meio fresco. Conecte o filtro novamente e empurre rapidamente o êmbolo.
A pressão do líquido força a célula em direção aos poros do filtro.
Isso produz uma vesícula esférica da membrana plasmática ou PMV.
Essas vesículas contêm componentes celulares e organelas cercadas pela membrana.
Examinar o filtrado ao microscópio de contraste de fase invertido para observar as vesículas esféricas translúcidas.
As dimensões das vesículas correspondem ao tamanho dos poros da membrana do filtro, confirmando a geração de PMVs.
Para gerar os PMVs, primeiro, cultive PMSCs de camundongos em meio de cultura DMEM completo em um poço de uma placa de seis poços em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 90% de confluência, enxágue o poço com 0,5 mililitros de PBS livre de cálcio e retire as células com 0,5 mililitros de tripsina-EDTA a 0,25%.
Após três minutos a 37 graus Celsius, bata na placa com a palma da mão algumas vezes para facilitar a dissociação celular e interromper a digestão com 1 mililitro de meio de cultura. Transfira as células para um tubo cônico de 5 mililitros para centrifugação e ressuspenda o pellet em 4 mililitros de meio de cultura fresco. Em seguida, divida as células entre dois poços de uma nova placa de seis poços e devolva a placa à incubadora de cultura de células por 24 horas.
No dia seguinte, colha as células de um poço por digestão de tripsina, como acabamos de demonstrar, ressuspendendo o pellet em 0,5 mililitros de meio de cultura fresco após a coleta por centrifugação. Carregue as células em uma seringa de insulina de 1 mililitro e conecte a seringa a uma unidade de filtro. Pressione rapidamente o êmbolo para espremer as células através do filtro e descarte o meio extrudido. Em seguida, carregue e dispense 0,5 mililitros de meio de cultura extra através do filtro, como acabamos de demonstrar, coletando o meio da segunda extrusão.
Semeie 150 microlitros do meio coletado em um prato de fundo de vidro de 35 mililitros e deixe as vesículas assentarem por cerca de 10 minutos. Em seguida, confirme a presença de PMVs sob um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera CCD usando uma lente objetiva de 20 vezes.