Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:34 min. • July 8th, 2025
Comece com um tubo oral contendo uma suspensão de levedura auxotrófica geneticamente transformada que é incapaz de produzir nucleobase de uracila.
Insira o tubo oral na boca de um camundongo contido e guie-o até o estômago.
Administre a suspensão de levedura diretamente no estômago, permitindo que ela chegue ao intestino delgado.
O intestino delgado contém células epiteliais, com placas de Peyer subjacentes ricas em células imunológicas.
As células microdobradas, células epiteliais intestinais especializadas perto das placas de Peyer, engolfam as células de levedura e as internalizam em vesículas.
Essas vesículas se movem pelas células e liberam células de levedura na mancha de Peyer subjacente.
Isole o adesivo de Peyer do intestino de camundongo sacrificado e obtenha uma suspensão celular uniforme.
Cultivar esta suspensão celular num meio selectivo para leveduras contendo uracila.
A levedura auxotrófica utiliza o uracilo e se multiplica para formar colônias, confirmando a entrega de células de levedura transformadas no sistema imunológico intestinal do camundongo.
Depois de preparar as culturas de levedura de acordo com o protocolo de texto, use um hemocitômetro para determinar a concentração de células e ajuste para 10 elevado à nona célula por mililitro. Pulverize as células por centrifugação a 2.500 vezes g por três minutos. Em seguida, despeje o sobrenadante e ressuspenda as células adicionando o volume apropriado de água estéril e pipetando suavemente para cima e para baixo.
Fixe uma agulha de gavagem de calibre apropriado em uma seringa estéril de 1 mililitro e carregue a amostra de levedura, eliminando quaisquer bolhas de ar. Carregue uma seringa adicional com água estéril para gavagar camundongos de controle. Usando a mão não dominante, pegue o mouse a ser gavaged e, com o dedo indicador e o polegar, segure firmemente a pele ao redor do pescoço. Coloque a cauda sob o dedo mindinho. Certifique-se de que o aperto esteja seguro e proíba o mouse de mover a cabeça.
Em seguida, insira suavemente a agulha de gavagem no esôfago do camundongo, inclinando a agulha ao longo do céu da boca e da parte de trás da garganta, mantendo-se ligeiramente à esquerda do centro. Espere o mouse engolir o bulbo da agulha. Se houver resistência ou o rato engasgar, remova suavemente a agulha e tente novamente encontrar o esôfago.
Depois que o camundongo engolir o bulbo da agulha gavagada, pressione suavemente o êmbolo da seringa para administrar o fermento diretamente no estômago do camundongo. Remova suavemente a agulha de gavagem do estômago e do esôfago do camundongo e retorne o camundongo à gaiola. Verifique se o mouse está respirando e se movendo normalmente para garantir que a gavagem foi realizada corretamente.
Após sacrificar o mouse de acordo com o protocolo de texto, posicione-o com o abdômen totalmente exposto e use etanol 70% para pulverizar a região abdominal. Com uma tesoura, faça uma incisão transversal através do pelo e da pele. Em seguida, abra manualmente a incisão para expor ainda mais o peritônio, o fino revestimento de serosa que cobre os órgãos abdominais. Levante suavemente o peritônio e faça uma incisão transversal para expor os intestinos.
Em seguida, use uma pinça romba para afastar cuidadosamente o intestino delgado das artérias mesentéricas, gordura e outros tecidos. Exponha o intestino delgado do estômago no quadrante superior esquerdo do abdômen do camundongo ao ceco, a grande bolsa de tecido intestinal no início do intestino grosso.
Em seguida, isole as manchas de Peyer procurando por manchas circulares de 1 a 2 milímetros de tecido opaco ao longo do intestino delgado. Em seguida, usando uma tesoura de dissecção curva, corte a cúpula do remendo de Peyer, deixando margens para garantir que nenhum tecido circundante seja coletado.
Transfira os adesivos de Peyer dissecados para o IMDM completo. Em seguida, despeje a solução com adesivos de Peyer suspensos em um filtro de células de 40 micrômetros. Depois de lavar os adesivos de Peyer com IMDM completo, use um êmbolo de uma seringa de 1 mililitro para quebrar suavemente o tecido e coletar as células em um tubo de 50 mililitros. Pulverize as células coadas a 1.800 RPM por sete minutos. Em seguida, aguarde e analise as células de acordo com o protocolo de texto.