Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:21 min. • July 8th, 2025
Pegue um tumor de melanoma murino composto por neutrófilos associados a tumores, ou TANs.
As TANs exibem atividade elevada da enzima nicotinamida fosforibosiltransferase, ou NAMPT, estimulando a angiogênese, a proliferação de vasos sanguíneos em tumores e facilitando o crescimento do tumor.
Pique o tecido e adicione enzimas para degradar a matriz do tecido, soltando as células.
Filtrar a suspensão através de um filtro e centrifugar para peletar as células.
Adicione um tampão de lise para lisar os glóbulos vermelhos e, em seguida, centrifugue e descarte o sobrenadante contendo detritos celulares.
Introduzir anticorpos para bloquear os receptores Fc celulares, evitando assim a imunomarcação inespecífica.
Introduza um coquetel de anticorpos marcado com fluoróforo específico para marcadores de superfície em TANs e um corante para discriminar células mortas.
Usando FACS, isole os TANs viáveis marcados com fluoróforo e transfira-os para uma microplaca.
Adicione um inibidor bloqueando a atividade NAMPT aos poços selecionados e incuba.
Use as células para avaliar sua capacidade de estimulação da angiogênese. As TANs tratadas com inibidores mostram angiogênese reduzida em comparação com as TANs não tratadas.
Para isolamento de neutrófilos associados ao tumor, coloque cinco tumores por poço em poços individuais de uma placa estéril de seis poços, à medida que são colhidos, e use uma tesoura estéril para picar os tumores em pedaços de 2 a 3 milímetros. Em seguida, digerir os fragmentos tumorais com 1 mililitro de colagenase à base de disco, solução de DNase I por 45 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade, misturando as amostras com uma seringa de 10 mililitros a cada 15 minutos.
No final da incubação, filtre as células através de filtros de 100 micrômetros em um tubo de 15 mililitros por poço para remover as fibras não digeridas e adicione PBS a um volume final de 15 mililitros. Colete as células dissociadas por centrifugação e lise os glóbulos vermelhos com 1 mililitro de tampão de lise por tubo.
Após a mistura, combine o conteúdo de cada tubo em um único tubo de 15 mililitros, interrompendo a reação após dois minutos com 11 mililitros de meio completo de 4 graus Celsius. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de PBBS e bloqueie qualquer ligação inespecífica com três microlitros de anticorpo bloqueado por FC por 15 minutos no gelo.
No final da incubação, rotule as células com anticorpos anti-CD11b e Ly6G e quaisquer outros anticorpos de interesse mais DAPI para uma incubação de 30 minutos em gelo protegido da luz. No final da incubação, lave as células em 14 mililitros de PBS e ressuspenda os pellets a uma concentração de 1 x 107 células por mililitro de meio fresco completo no gelo.
Em seguida, classifique os neutrófilos negativos para Ly6G com alto teor de DAPI positivo para CD11b em um classificador de células ativadas por fluorescência de acordo com os protocolos de classificação padrão, verificando a pureza dos neutrófilos isolados no citômetro de fluxo no final da classificação. Para inibição de neutrófilos associada a tumores in vitro, semeie 1,5 vezes 10 elevado ao quinto classificado neutrófilos em cada um dos dois poços de uma placa de fundo em U de 96 poços e adicione FK866 a uma concentração final de 100 nanomolares em meio completo em um poço e um volume igual de meio completo sozinho ao outro poço. Após duas horas na incubadora de cultura de células, lave as células duas vezes com PBS e ressuspenda os pellets em PBS na concentração apropriada para a injeção subsequente.