JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:12 min • July 8th, 2025
Comece com uma suspensão de Mycobacterium bovis BCG, tratada com um surfactante não iônico, para evitar a aglomeração bacteriana.
Em seguida, adicione um reagente de biotinilação e incuba.
Este reagente de biotinilação, um complexo de biotina complexado a um ligante funcional, facilita a ligação de moléculas de biotina a proteínas de superfície bacteriana, marcando bactérias.
Após a incubação, centrifugue a suspensão bacteriana marcada com biotina para remover o reagente de biotinilação não reagido.
Ressuspenda as bactérias em um tampão. Adicionar uma solução de proteína de fusão de avidina, uma proteína recombinante que compreende um domínio de antigénio alvo fundido com avidina monomérica.
Durante a incubação, a avidina se liga à biotina, facilitando a modificação da superfície bacteriana com antígenos-alvo.
Centrifugue a suspensão para remover as proteínas de fusão não ligadas.
Ressuspenda as bactérias revestidas de antígeno em um tampão contendo um surfactante não iônico. O revestimento de antígeno na bactéria pode aumentar sua propriedade de desencadear respostas imunológicas.
Trabalhe em um gabinete de biossegurança usando equipamentos de proteção individual porque o BCG é um patógeno de nível II.
Para biotinilar a superfície das células BCG, primeiro, cultive as células em uma plataforma agitadora até a densidade adequada. Colete cerca de 1 bilhão de células e lave-as três vezes usando 500 microlitros de PBST sem endotoxinas geladas. Em seguida, gire as células e suspenda-as em PBS estéril sem endotoxinas. Em seguida, prepare a biotina fresca de Sulfo-NHS SS de 10 milimolares em água filtrada estéril. Em seguida, incube as bactérias em 1 mililitro de caldo contendo 0,5 milimolar de biotina Sulfo-NHS SS. Realize a incubação em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, lave as bactérias agora rotuladas três vezes com 500 microlitros de PBST gelado, para remover o reagente que não reagiu. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de PBST.
Misturar 500 milhões de BCGs biotinilados com proteína de fusão avidina, para uma concentração final de 10 microgramas de proteína por mililitro. Deixe essa reação agir por uma hora em temperatura ambiente em uma coqueteleira. Em seguida, lave as bactérias três vezes com 500 microlitros de PBST gelado.