Geração de células T CD8 positivas únicas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

Células-tronco pluripotentes induzidas por cultura em uma camada alimentadora de células estromais em uma matriz de gelatina.

A camada alimentadora imita o ambiente extracelular natural, guiando a diferenciação de células-tronco em organoides em forma de cúpula contendo células progenitoras hematopoiéticas.

Adicione enzimas para dissociar as células co-cultivadas.

Transfira as células para um prato fresco revestido de gelatina para adesão das células estromais.

Coletar as células progenitoras hematopoiéticas não aderidas em um meio de diferenciação.

Cultive-os em uma camada alimentadora fresca para promover a diferenciação de células progenitoras em células T duplamente positivas com receptores CD4 e CD8 e células T duplamente negativas sem ambos os receptores.

Transfira as células para um tubo. Incube-os com esferas magnéticas carregando anticorpos específicos para CD4 que marcam seletivamente as células T duplamente positivas.

Use um separador magnético para isolar as células duplamente positivas e cultive-as em uma nova camada de alimentação.

Suplemento com uma mistura de citocinas e anticorpos para estimular as células, induzindo a regulação negativa do receptor CD4 e promovendo sua diferenciação em células CD8 únicas positivas.

Prepare pratos OP9-delta-1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com IPSCs humanos. Adicione 4 mililitros de gelatina a 0,1% a três novas placas de cultura de células e incube-as por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspire a gelatina e adicione 8 mililitros de meio OP9 a cada prato. Passe uma placa confluente de células OP9-delta-1 para três placas revestidas de gelatina.

Após quatro dias, adicione 10 mililitros de mídia OP9 a cada prato de células para um total de 20 mililitros de meio por prato. Comece a co-cultura de IPSC humana em placas de confluência OP9-delta-1 sete a oito dias após a passagem das células. Aspire o meio de uma antena confluente de IPSCs humanos e adicione 10 mililitros de meio OP9.

Corte e destaque as colônias de células usando uma ferramenta descartável de passagem de células e transfira de 350 a 600 aglomerados de colônias cortadas para um prato OP9-delta-1 pré-gelatinizado com 10 mililitros de meio OP9 fresco. Balance o prato de cultura de um lado para o outro e da frente para trás para garantir uma distribuição uniforme das colônias. No dia seguinte, aspire o meio gasto e substitua-o por 20 mililitros de meio OP9 novo.

Os aglomerados de IPSC humanos co-cultivados em OP9-delta-1 por um dia devem aparecer como pequenas colônias redondas de monocamada. No dia 5, aspire 10 mililitros de meio gasto e adicione 10 mililitros de meio OP9 fresco. As colônias começarão a se diferenciar em mesoderma primitivo, que é caracterizado por um centro escuro de várias camadas.

Repita esse processo no dia 9, momento em que as estruturas centrais multicamadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas. Colha as células progenitoras hematopoiéticas no dia 13, momento em que as estruturas são compostas por um organoide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas. Aspire o meio e lave as células uma vez com 5 mililitros de 1x solução salina balanceada de Hank sem vermelho de fenol com cálcio e magnésio ou HBSS.

Após a lavagem, adicione 250 microlitros de 5.000 unidades por mililitro de colagenase-4 a 10 mililitros de HBSS. Adicione a mistura às células e incube-as a 37 graus Celsius por 45 minutos. Aspire a mistura HBSS-colagenase e lave as células uma vez com 5 mililitros de PBS. Após a lavagem com PBS, adicione 5 mililitros de tripsina-EDTA a 0,25% e incube as células a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, adicione 4 mililitros de meio OP9 e associe a camada de células pipetando para fazer uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um filtro de 100 micrômetros e centrifugue o tubo a 300 vezes g e 4 graus Celsius por 5 minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio OP9.

Coloque a suspensão celular em uma nova placa de cultura de células gelatinizada de 10 centímetros e incuba-as a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, colete todas as células não aderentes por pipetagem suave. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de uma peneira e centrifugue conforme descrito anteriormente. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de meios de diferenciação.

Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9-delta-1. Passe as células no dia 16 de acordo com as instruções do manuscrito e continue passando as células não aderentes a cada cinco a sete dias depois disso. Após 35 dias de diferenciação, enriqueça a população de células CD4-positivas pelo isolamento de esferas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante.

Em seguida, ressuspenda as células em meio OP9 e coloque 1 mililitro de suspensão celular em cada poço de uma placa de 24 poços de OP9-delta-1 confluente para cultura de tecidos. Estimule as células adicionando 100 unidades internacionais de IL-2 humana, 5 nanogramas de IL-7 humana, 500 nanogramas de anticorpo anti-CD3 humano e 2 microgramas de anticorpo anti-CD28 humano a cada poço. Após quatro a sete dias, as células podem ser coletadas para análise posterior.