Cultura de neurônios excitatórios fluorescentes de um cérebro de filhote de camundongo transgênico

Pegue um cérebro de filhote de camundongo transgênico.

Remova o cerebelo e disseque o cérebro. Separe o tecido cortico-hipocampal contendo neurônios excitatórios que expressam proteínas fluorescentes.

Transfira o tecido para uma placa de cultura contendo tampão.

Pique o tecido e transfira-o para um tubo contendo papaína.

A papaína digere a matriz extracelular do tecido, soltando células, incluindo neurônios.

Transfira o tecido digerido para um tubo com proteínas BSA, interrompendo a atividade enzimática e evitando danos celulares.

Dissociar mecanicamente os tecidos, liberando células.

Centrifugue e remova o sobrenadante contendo detritos e enzimas.

Ressuspenda as células em meio neuronal de baixa fluorescência e filtre através de um filtro celular, removendo os agregados celulares.

Execute a classificação de células ativadas por fluorescência para identificar e classificar os neurônios fluorescentes.

Transfira os neurônios classificados para um tubo de microcentrífuga e centrífuga. Ressuspenda neurônios em meios neuronais.

Semeie neurônios em lamínulas revestidas com poli-L-lisina em uma placa de vários poços. Os neurônios aderem às superfícies revestidas.

Adicione mídia neuronal. Incubar para facilitar o crescimento neuronal.

Primeiro, disseque o cerebelo e separe os dois hemisférios. Em seguida, separe cuidadosamente o hipocampo e o córtex de cada hemisfério. Transfira o tecido dissecado para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo tampão de cultura de células resfriado.

Em seguida, transfira o hipocampo e o córtex dissecados para a tampa de outra placa de Petri de 35 milímetros. Usando a borda plana de uma lâmina de bisturi, pique cuidadosamente o tecido em um movimento cruzado até que restem apenas pequenos pedaços.

Em seguida, transfira o tecido picado com uma pequena quantidade de solução de papaína da tampa da placa de Petri para o tubo estéril de papaína. Incube o tecido a 37 graus Celsius por 25 minutos. Após a incubação da papaína, transfira o tubo de papaína estéril e os tubos BSA estéreis para o gabinete de fluxo. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de 1 mililitro para transferir apenas o tecido cortico-hipocampal do tubo de papaína para o tubo BSA 1.

Para quebrar quaisquer grandes aglomerados de tecido, triture o tecido várias vezes usando uma pipeta Pasteur de 1 mililitro. Em seguida, triturar o tecido sete vezes usando uma pipeta Pasteur de ponta fina. Após 30 segundos, transfira 1 mililitro da solução inferior e do tecido do tubo BSA 1 para o tubo BSA 2.

Triturar o tecido no tubo BSA 2 várias vezes usando uma pipeta Pasteur de ponta fina. Após a trituração, transfira 1 mililitro do tecido inferior em solução do tubo BSA 1 para o tubo BSA 3. Triturar o tecido no tubo BSA 3 várias vezes.

Após a trituração, transfira toda a solução e tecido dos tubos 2 e 3 para o tubo BSA 1. Triturar mais 2 a 3 vezes e centrifugar a 3.000 vezes g por 3 minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do tecido peletizado e ressuspenda as células usando uma pipeta P1000 em 2 mililitros de meio completo de baixa fluorescência Hibernate A. Em seguida, triture o tecido 20 vezes para garantir a ressuspensão completa da solução de tecido.

Em seguida, filtrar a suspensão celular através de uma peneira de células de 30 micrômetros em um tubo de amostra de poliestireno. Prepare os tubos de coleta de classificação de células pipetando 300 microlitros de meio Hibernate A completo para o número necessário de tubos de polipropileno.

Para cada tipo de célula fluorescente a ser classificado, escolha os filtros de excitação e emissão apropriados. Excite a proteína venosa usando o comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e detecte a luz emitida através do conjunto de filtros de emissão 530 sobre 40.

Excite a proteína TdTomato usando o comprimento de onda de excitação de 531 nanômetros e detecte a luz emitida através do conjunto de filtros de emissão 575 sobre 30. Para alta pureza, classifique as células fluorescentes marcadas com cores vivas. Após a classificação das células, transfira as células coletadas para tubos de centrífuga de fundo redondo de 2 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 3.000 vezes g por 3 minutos para formar um pellet de célula.

Ressuspenda o pellet celular na quantidade necessária de meio NBA completo pré-aquecido para atingir uma densidade celular de 1.000 células por microlitro. Para confirmar a presença de células dissociadas, verifique a solução celular ao microscópio usando uma lente objetiva de 4x ou 10x. Antes de plaquear as células, faça um vórtice a uma velocidade média por 2 a 3 segundos para garantir uma suspensão uniforme da célula.

Após o vórtice, pipete rapidamente 10 microlitros da suspensão celular para o centro de cada lamínula. Após uma hora, alimente as células com 500 microlitros de meio NBA completo pré-aquecido e retorne à incubadora a 37 graus Celsius.