JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:51 min • July 8th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo uma inserção porosa que contém um andaime de poliestireno que possui uma estrutura porosa tridimensional.
Adicione etanol para reidratar o andaime e lave-o com o meio.
Introduzir um meio contendo uma proteína da matriz extracelular, a laminina. Incubar para permitir que a laminina cubra o andaime.
Semeie as células-tronco neurais humanas em um meio neural contendo fatores de crescimento no andaime revestido de laminina.
Incubar para permitir a migração das células-tronco para o andaime poroso, onde a laminina promove a adesão celular ao andaime.
As células utilizam os fatores de crescimento e proliferam dentro desse andaime.
Adicione um meio neural livre de fator de crescimento e substitua regularmente o meio gasto para manter a viabilidade celular.
A ausência de fatores de crescimento estimula a diferenciação de células-tronco em células progenitoras neurais.
Com o tempo, os processos neurais dessas células progenitoras se alongam, permitindo o crescimento celular multidirecional e formando uma cultura tridimensional.
Reidrate os andaimes adicionando a cada poço da placa de 12 poços Alvetex, 2 mililitros de etanol a 70%, preparados com água para irrigação. Evite tocar nos andaimes dispensando o etanol a 70% na parede de cada poço. Aspire cuidadosamente o etanol a 70% e lave imediatamente os andaimes com 2 mililitros por poço de DMEM F12 por um minuto.
Repita o procedimento de lavagem duas vezes. Aspire cuidadosamente o DMEM F12 após a lavagem final. Cubra os andaimes adicionando 2 mililitros de laminina em DMEM F12 a cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por no mínimo duas horas.
Em seguida, lave a placa com DMEM F12 quente. Semeie cada andaime com aproximadamente 500.000 células-tronco neurais humanas ou HNSCs em um volume de 150 microlitros de meio RMM com fatores de crescimento. Incube a placa por três horas para permitir que as células se depositem nos andaimes.
Após três horas, adicione 3,5 mililitros de RMM a cada poço, tomando cuidado para não desalojar as células dos andaimes. Incube a placa por sete ou 21 dias. Substitua o meio após um dia, que é a primeira alimentação, e substitua o meio novamente 2 a 3 dias após a primeira alimentação.