Diferenciação induzida por estimulação elétrica de células-tronco neurais e progenitoras

Comece com um chip microfluídico MOE conectado a uma fonte elétrica.

O chip contém regiões de cultura revestidas de poli-L-lisina conectadas com portas de entrada e saída, juntamente com eletrodos Ag/AgCl montados para conexões elétricas.

Coloque o chip microfluídico em um aquecedor para condições ideais de crescimento.

Fluxo de células-tronco neurais e progenitoras ou NPCs para as regiões de cultura revestidas através das saídas.

As células interagem eletrostaticamente com a poli-L-lisina e aderem ao dispositivo microfluídico.

Em seguida, introduza um meio de crescimento contendo fatores de crescimento que facilitem a proliferação das células aderidas.

Aplique uma corrente elétrica através dos eletrodos Ag/AgCl por um período mais longo com fornecimento contínuo de meio para viabilidade celular.

A corrente elétrica excita e ativa os NPCs, promovendo a extensão dos processos neuronais dos corpos celulares.

Além disso, a estimulação elétrica desencadeia várias vias de sinalização intracelular.

Essas vias promovem que os NPCs se diferenciem especificamente em várias células neurais, como neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Para começar, desenhe padrões para camadas individuais de PMMA e fita dupla-face usando o software apropriado. Ligue o gravador a laser de dióxido de carbono e conecte-o a um computador pessoal. Abra o arquivo de padrão de design usando o software.

Coloque as folhas de PMMA ou fita dupla-face na plataforma do riscador a laser. Em seguida, concentre o laser na superfície das folhas de PMMA ou na fita dupla-face usando a ferramenta Foco automático. Selecione o scriber a laser como impressora. Em seguida, use o riscador a laser para iniciar a ablação direta na folha de PMMA ou fita dupla face.

Remova a película protetora das folhas de PMMA e limpe a superfície com gás nitrogênio. Para unir várias camadas de folhas de PMMA, empilhe três pedaços de folhas de PMMA de 1 milímetro e cole-as sob uma pressão de 5 quilos por centímetro quadrado em um adesivo térmico por 30 minutos a 110 graus Celsius para formar o fluxo ou conjunto do canal de estimulação elétrica. Cole 12 peças de adaptadores nas aberturas individuais na camada um do conjunto do chip MOE com cola de cianoacrilato de ação rápida.

Desinfete os substratos de PMMA de 1 milímetro, a fita dupla-face e o PMMA óptico de 3 milímetros usando irradiação ultravioleta por 30 minutos antes de montar o chip. Cole os substratos de PMMA de 1 milímetro no PMMA óptico de 3 milímetros com a fita dupla face para concluir a montagem do PMMA. Cole a lamínula limpa no conjunto PMMA com a fita dupla-face.

Sele as aberturas dos adaptadores da ponte de ágar com tampões brancos apertados com os dedos. Conecte o conector de fundo plano ao conjunto do chip MOE por meio dos adaptadores de entrada e saída médios. Em seguida, conecte o adaptador cone-Luer às torneiras de três vias. Adicione 2 mililitros de solução PLL a 0,01% usando uma seringa de 3 mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada do meio e conecte uma seringa vazia de 3 mililitros à torneira de três vias da saída do meio.

Encha as regiões de cultura de células com a solução PLL e bombeie lentamente a solução de revestimento para frente e para trás. Feche as duas torneiras de três vias para selar a solução dentro das regiões de cultura. Incube o chip MOE a 37 graus Celsius durante a noite em uma incubadora cheia de 5% de atmosfera de dióxido de carbono. Abra as duas torneiras de três vias e lave as bolhas nos canais bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas.

Retire 3 mililitros de meio completo em uma seringa de 3 mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada do meio e adicione-a para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura de células. Substitua o plugue branco apertado com os dedos pelo adaptador Luer e injete agarose quente a 3% para encher o adaptador. Conecte a seringa Luer-lock ao adaptador Luer e injete agarose quente a 3% através do tampão de borracha preta para encher a seringa Luer-lock. Aguarde de 10 a 20 minutos para que a agarose esfrie e solidifique.

Instale o chip MOE semeado por célula no aquecedor ITO transparente que é fixado em um estágio motorizado XYZ programável mantido a 37 graus Celsius. Infunda os mNPCs bombeando manualmente para o chip MOE através da saída média. Em seguida, incube o chip MOE semeado por célula no aquecedor ITO por 4 horas.

Use fios elétricos para conectar um multiplexador EF ao chip MOE por meio dos eletrodos no chip. Conecte um multiplexador EF e um gerador de funções a um amplificador para emitir pulsos CC de onda quadrada.