Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Pegue colônias de células-tronco pluripotentes induzidas, ou iPSCs, cultivadas em uma matriz de suporte.

Adicione uma solução contendo enzimas para dissociar as colônias em células únicas.

Transfira as células para um tubo, centrifugue-as e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os iPSCs em um meio de crescimento.

Transfira as células para uma microplaca contendo fibras poliméricas biocompatíveis.

Centrifugue para forçar o agregado de iPSCs, formando corpos embrióides, ou EBs, no andaime de polímero.

Transição para um meio de indução neural que promove a proliferação e diferenciação de iPSC em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos.

Após a incubação, as células sofrem auto-organização.

Coloque os corpos embrióides em uma folha com covinhas e adicione gotas contendo proteínas da matriz extracelular.

Incubar para solidificar a matriz, incorporando os EBs.

Transfira os EBs para uma microplaca contendo um meio de manutenção neural. Incubar.

Os EBs sofrem proliferação celular para formar saliências e brotamentos e se diferenciar em neurônios maduros, formando organoides cerebrais.

Aspire o meio com uma pipeta e lave as células uma vez com DPBS. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de descolamento celular, ou EDTA 0,5 milimolar, para dissociar as colônias e incube a 37 graus Celsius por 3 a 5 minutos. Em seguida, adicione 1 mililitro de meio E8 fresco a cada poço e pipete suavemente para separar todas as células.

Transfira toda a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 milímetros e adicione mais 1 mililitro de meio E8 fresco. Em seguida, gire as células a 290 g por 3 minutos em temperatura ambiente.

Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 1 mililitro de meio E6, suplementado com inibidor de ROCK 50 micromolar, e conte as células usando um hemocitômetro.

Preparar uma suspensão celular com a densidade de assentamento desejada em meio E6, suplementada com o inibidor de ROCK. Em seguida, adicione 150 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa de 96 poços.

Em seguida, centrifugue a placa a 290 g por 3 minutos à temperatura ambiente para agregar as células à força. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono para a formação do corpo embrióide.

Após 24 horas de incubação, transfira a placa para o capô e aspire cuidadosamente 120 microlitros do meio com uma pipeta, tomando cuidado para não aspirar o corpo embrióide abaixando muito a ponta da pipeta no poço.

Em seguida, adicione 150 microlitros de meio E6 fresco, suplementado com 2 micromolares XAV939 e os inibidores de SMAD em cada poço. Transfira a placa de volta para a incubadora e substitua o meio diariamente por E6 recém-preparado, complementado com os inibidores.

No sétimo dia de incubação, verifique se todos os corpos embrióides atingiram um diâmetro de 550 a 600 micrômetros e exibem uma borda lisa e clara. Nesta fase, eles estão prontos para serem incorporados em uma matriz extracelular.

Para incorporar os organoides, prepare folhas de incorporação com covinhas colocando uma folha de filme de vedação termoplástica de 4 polegadas de comprimento em uma caixa P200 vazia. Em seguida, use um tubo cônico de 15 mililitros ou um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros e pressione suavemente a folha de filme nos orifícios para fazer 12 ou o número desejado de covinhas.

Em seguida, borrife etanol 70% na folha de filme e deixe secar dentro do capô com a luz ultravioleta acesa por pelo menos 30 minutos. Enquanto isso, descongele uma quantidade suficiente de matriz da membrana basal no gelo. Em seguida, usando uma ponta P200 de diâmetro largo, transfira um corpo embrióide da placa de 96 poços para cada covinha. Remova o máximo de mídia possível com uma ponta de pipeta normal, mas não deixe o corpo embrióide secar.

Em seguida, com uma ponta P200 pré-resfriada regular, adicione aproximadamente 30 microlitros de matriz de membrana não diluída a cada organoide, garantindo que o corpo embrióide esteja o mais próximo possível do centro da gota.

Depois que todos os corpos embrióides estiverem embutidos na matriz, coloque a folha de filme em uma placa de Petri estéril. Em seguida, incube a placa de Petri a 37 graus Celsius por 10 minutos em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono para permitir que a matriz da membrana se solidifique.

Para diferenciação de organoides, adicione 5 mililitros do meio de diferenciação preparado com B27 sem vitamina A a um poço de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa. Pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora. Uma vez que a matriz da membrana tenha solidificado, transfira os corpos embrióides embutidos para a placa de 6 poços, empurrando as covinhas da parte de trás da folha de filme. Se necessário, use 1 mililitro de meio do poço e pipete-o na folha para separar as gotículas da folha de filme.