Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

Pegue um córtex cerebral de camundongo recém-colhido.

Corte o tecido em pequenos fragmentos. Transfira-os para um homogeneizador resfriado contendo um tampão com inibidores de RNase e DNases.

Homogeneizar o tecido de forma otimizada para liberar as células em suspensão, preservando seletivamente a microglia devido à sua capacidade de suportar forças de cisalhamento e manter a viabilidade da membrana, enquanto elimina neurônios e outras células gliais.

Além disso, os inibidores de RNase degradam as RNases, enquanto as DNases degradam qualquer DNA contaminante.

Passe a suspensão celular por um filtro de células para remover os detritos do tecido.

Transfira a suspensão celular para um tubo. Centrifugue e remova o sobrenadante contendo enzimas. Ressuspenda as células em um buffer.

Adicione microesferas magnéticas anti-mielina. Essas microesferas têm como alvo a proteína mielina, ligando-se a detritos de mielina e oligodendrócitos.

Carregar a mistura célula-grânulo numa coluna de depleção constituída por uma matriz com esferas ferromagnéticas.

Sob o campo magnético aplicado, os detritos de mielina ligados a microesferas e oligodendrócitos são retidos dentro da coluna, enquanto as células microgliais passam.

Lave a coluna com tampão e recolha o fluxo contínuo contendo microglia.

Primeiro, use uma lâmina de barbear para cortar cada região do cérebro em pedaços finos com menos de 1 milímetro cúbico. Usando uma pipeta de 1 mililitro com a ponta cortada, transfira os pedaços de tecido para homogeneizadores Dounce pré-resfriados. Homogeneizar o tecido girando lentamente o pistão para dentro e para fora do homogeneizador Dounce por 6 a 10 movimentos completos até que nenhum pedaço visível esteja presente. Em seguida, transfira os tecidos dissociados para tubos de 50 mililitros através de filtros de 70 micrômetros.

Enxágue cada homogeneizador e pistão Dounce com um total de 6 mililitros de meio frio A e, em seguida, transfira o enxágue para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Centrifugue a suspensão de célula única a 400 vezes g e a 4 graus Celsius por 5 minutos com uma pausa em 5.

Enxágue uma grande coluna de depleção e três grandes colunas de seleção em um separador magnético com 3 mililitros de MCS. Quando a centrifugação das amostras de tecido estiver concluída, pipetar e rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspenda as células no tampão MCS que contém inibidor de RNase.

Adicione 100 microlitros de esferas de remoção de mielina a cada tubo contendo células ressuspensas do córtex e cerebelo, e adicione 50 microlitros de esferas de remoção de mielina a cada um dos tubos contendo células ressuspensas do hipocampo e estriado. Incube os tubos no gelo por 10 minutos.

Depois disso, adicione MCS ao tubo contendo células corticais para aumentar seu volume para 2 mililitros e aos tubos restantes para elevar cada um de seus volumes para 1 mililitro. Quando as colunas estiverem vazias de tampão de enxágue, carregue 2 mililitros de células corticais na grande coluna de depleção e 1 mililitro de cada outra suspensão de células em colunas de seleção grandes separadas. Em seguida, lave a coluna de depleção grande uma vez com 1 mililitro de tampão MCS e lave cada coluna de seleção grande duas vezes usando 1 mililitro de tampão MCS para cada lavagem.