Uma técnica simples para isolar e cultivar astrócitos murinos

Corte o córtex de um camundongo em pedaços pequenos e transfira para um meio de dissecação a frio contendo uma solução salina tamponada.

Adicione enzimas digestivas para dissociar a matriz extracelular.

Para remover enzimas residuais, lave com o meio de dissecção a frio.

Substitua este meio por um meio de enriquecimento de astrócitos.

Em seguida, use uma pipeta para dissociar os pedaços de tecido.

Passe a suspensão por um filtro para remover o tecido não dissociado e obter células únicas.

Transfira as células para uma placa revestida de polímero carregada positivamente. Incubar com agitação.

Os astrócitos aderem firmemente, enquanto os neurônios, micróglia e oligodendrócitos fracamente ligados se desprendem.

O meio de enriquecimento converte astrócitos maduros em astrócitos poligonais em divisão.

Remova as células destacadas e lave os astrócitos com um tampão fosfato.

Adicione enzimas digestivas para separar os astrócitos.

Adicione um meio contendo soro para interromper a atividade enzimática. Colete os astrócitos em um tubo e centrifugue.

Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em um meio de maturação de astrócitos para promover uma estrutura típica de astrócitos maduros em forma de estrela.

Corte qualquer tecido cortical a ser usado para gerar astrócitos em pedaços não maiores que 1 milímetro cúbico. Depois que todos os pedaços de tecido forem coletados, espere que eles se depositem no fundo do tubo. Em seguida, aspire o máximo de meio possível. Em seguida, adicione 2 a 3 mililitros de tripsina EDTA a 0,05% e incube as amostras em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, aspire cuidadosamente a tripsina EDTA, deixando pedaços de tecido em uma quantidade mínima de líquido no fundo do tubo. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio de dissecção pré-resfriado para lavar a tripsina EDTA restante e pipete para o lado do tubo superior para obter a mistura dos pedaços de tecido. Em seguida, aspire o meio de dissecção e deixe os pedaços de tecido no mínimo de líquido possível.

Repita esta etapa de lavagem com meio de dissecção pré-resfriado duas vezes. Após a etapa final de lavagem, adicione 1 mililitro de DMEM PLUS em temperatura ambiente e titule o tecido pipetando para cima e para baixo sem introduzir bolhas.

Os astrócitos são bastante sensíveis ao pH, por isso é importante evitar a produção de bolhas, pois isso pode alterar o pH da solução.

Em seguida, coloque um filtro de célula de 100 mícrons na abertura de um tubo de 50 mililitros e pré-umedeça o filtro com 4.5 mililitros de DMEM PLUS pré-resfriado. Pipete 1 mililitro da suspensão de tecido dissociado no filtro de células e adicione mais 4,5 mililitros de DMEM PLUS pré-resfriado para lavar as células através dele. No dia in vitro 7 após a dissecção, colocar as placas de 10 centímetros com células em DMEM PLUS em uma coqueteleira na incubadora e agitar as placas a 110 RPM por seis horas.

20 a 30 minutos antes do final da agitação de seis horas, pré-aqueça 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H e 0,25% de tripsina EDTA a 37 graus em banho-maria. Após seis horas de agitação, retire as placas de cultura da coqueteleira e substitua imediatamente o meio por 10 mililitros de PBS 1X pré-aquecido por prato. Em seguida, remova o PBS e adicione 3 mililitros de tripsina EDTA pré-aquecida por prato.

Em seguida, incube as amostras por quatro minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 5 mililitros de DMEM PLUS pré-aquecido a 3 mililitros de tripsina EDTA em cada prato. Pipetar as células do prato e recolher a suspensão celular num tubo de 50 mililitros. Depois disso, centrifugue a suspensão celular a 3.220 vezes g a 20 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 1 mililitro de NB + H pré-aquecido.