JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:00 min • July 8th, 2025
Comece com uma câmara microfluídica revestida de polímero com poços proximais e distais conectados por meio de vários microsulcos.
No poço proximal, coloque tecidos embrionários da medula espinhal de camundongos ricos em neurônios motores em desenvolvimento.
Complemente bem com um meio nutriente. Incubar para permitir o crescimento dos neurônios e a aderência à superfície revestida de polímero.
Mais tarde, adicione um meio nutriente livre de fator de crescimento ao poço proximal.
Em poços distais, adicione um volume maior de meio nutriente contendo fatores de crescimento para criar diferenças de concentração e volume.
Essas diferenças fazem com que os axônios, as projeções neuronais mais longas, cresçam em direção aos poços distais através dos microsulcos.
Adicione uma solução de corante fluorescente em ambos os poços.
As moléculas de corante entram nos neurônios e mancham as mitocôndrias e organelas ácidas em ambas as extremidades.
Na imagem confocal ao vivo, as organelas coradas com fluorescência se movem em ambas as direções entre os corpos celulares neurais e os axônios, confirmando o transporte axonal nos neurônios motores.
Descarte todo o meio do compartimento proximal do MFC. Pegue um único explante da medula espinhal com uma pipeta em um volume total de quatro microlitros e injete-o o mais próximo possível da caverna. Retire o excesso de líquido do poço proximal através das saídas laterais. Repita a etapa anterior mais duas vezes e certifique-se de que os explantes estejam embutidos no canal proximal. Lentamente, adicione 150 microlitros de meio SCEX ao poço proximal.
Um dia após o plaqueamento, recoloque o meio SCEX no compartimento proximal e adicione meio SCEX rico ao compartimento distal, mantendo um gradiente de volume de pelo menos 15 microlitros por poço entre os poços distal e proximal. Após quatro a seis dias, os axônios devem cruzar para o compartimento distal e estar prontos para a imagem do transporte axonal.
Para rotular as mitocôndrias e os compartimentos ácidos, prepare o meio SCEX fresco com 100 nanomolares Mitotracker vermelho escuro FM e 100 nanomolares LysoTracker vermelho e adicione-o às câmaras microfluídicas. Incube-os por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius e depois lave três vezes com meio SCEX quente. Prossiga com a imagem ao vivo do transporte axonal, adquirindo uma série de imagens de lapso de tempo de 100 em intervalos de 3 segundos com um total de 5 minutos por filme.