Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:51 min. • July 8th, 2025
Pegue um rato sacrificado.
Abra o abdômen, excise a bexiga e mergulhe-a no tampão.
Abra a bexiga e remova a gordura aderente e os detritos de tecido.
Transfira a bexiga para um tubo contendo tampão, centrífuga e remova os detritos.
Coloque o tecido em uma solução contendo colagenase e pique-o. Adicione mais colagenase para degradar a matriz extracelular, soltando as células.
Centrifugue e descarte o sobrenadante. Adicione tripsina para interromper as junções célula-célula, liberando as células.
Adicione meios de enxágue contendo proteínas para inativar a tripsina, centrifugue e remova o sobrenadante.
Ressuspenda as células no meio; filtre-as para remover agregados e obtenha uma suspensão de célula única.
Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células na mídia.
Coloque as células em lamínulas revestidas para facilitar a fixação das células neuronais e gliais. Remova as células não anexadas.
Adicione meios de neurônios contendo fatores de crescimento para promover a maturação celular, estabelecendo uma cultura neuronal e glial primária.
Comece colocando os ratos em uma toalha cirúrgica esterilizada e expondo o abdômen. Use tesouras e fórceps para abrir a cavidade abdominal e revelar a bexiga. Use outro conjunto de tesouras e pinças para levantar suavemente a bexiga e cortá-la do colo da bexiga.
Em seguida, coloque rapidamente a bexiga em solução Krebs fria e estável ao oxigênio para melhorar a sobrevivência celular. Adicione a solução de Krebs em três pratos de vidro e três copos de vidro e coloque-os em um banho de gelo para pré-resfriamento. Numere os pratos e copos 1, 2 e 3 para evitar confusão.
No prato de vidro 1, abra a bexiga com uma tesoura oftálmica e desdobre-a com uma pinça e uma colher divisor de núcleo. Lave a bexiga no copo de vidro 1 e coloque-a no prato de vidro 2. Elimine a gordura aderente na superfície do tecido usando a pinça e a tesoura oftálmica. Em seguida, lave a bexiga no copo 2 e coloque-a no prato 3.
Raspe suavemente a bexiga usando a pinça e o divisor do núcleo da colher para remover os anexos exógenos. Enxágue a bexiga em um copo de vidro 3 e transfira-a para um tubo de centrífuga de 15 mililitros com 14 mililitros de solução fria de Krebs. Centrifugue a amostra por 1 minuto a 360 vezes g e 4 graus Celsius.
Transfira a bexiga do tubo de centrífuga para um frasco de 2 mililitros contendo 1 mililitro de solução de digestão. Use uma tesoura oftálmica para cortar a bexiga em pedaços pequenos. Misture a solução da bexiga com 9 mililitros de solução de digestão 1 em uma placa de cultura de células estéril. Realize a primeira digestão em uma incubadora agitada por 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 200 RPM. Após a primeira digestão, centrifugue a solução a 300 vezes g e 4 graus Celsius por 8 minutos.
Enquanto isso, coloque a solução de digestão 2 em banho-maria a 37 graus Celsius para pré-aquecimento. Após a centrifugação, remova a maior parte do sobrenadante que contém a solução de digestão 1, deixando um pouco de sobrenadante para evitar a perda celular.
Ressuspenda as células na solução de digestão quente 2 e agite a mistura enquanto digere em banho-maria a 37 graus Celsius por 5 minutos. Quando a digestão estiver concluída, desative imediatamente a tripsina adicionando 10 mililitros de meio de enxágue frio. Centrifugue as células a 360 vezes g e 4 graus Celsius por 8 minutos. Em seguida, remova o máximo de sobrenadante possível para eliminar toda a tripsina.
Ressuspenda suavemente o sedimento com 3 mililitros de meio neural, certificando-se de não gerar bolhas de ar na solução. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Colete células por centrifugação a 360 vezes g a 4 graus Celsius por 8 minutos. Em seguida, ressuspenda suavemente os grânulos celulares em 1 mililitro de meio de neurônio A e adicione 500 microlitros de suspensão celular a cada poço de uma placa de 48 poços. Células de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.