Cultura de neurônios murinos primários compartimentados usando chips microfluídicos de plástico

Pegue um chip microfluídico de plástico compreendendo reservatórios e compartimentos somáticos, bem como reservatórios e compartimentos axonais, conectados por microranhuras.

Adicione uma solução de pré-revestimento para saturar os compartimentos e ranhuras, evitando o aprisionamento de bolhas de ar.

Aspire a solução, deixando os compartimentos principais cheios. Lave com tampão.

Cubra os poços com um polímero sintético que facilite a adesão neuronal. Lave com tampão e adicione meio de cultura para evitar que o chip seque.

Para semear uma suspensão de neurônios do hipocampo de ratos, aspire a mídia.

Carregar a suspensão nos reservatórios somáticos. Os neurônios entram e se ligam ao compartimento somático.

Adicione meios de cultura neuronais aos poços e incuba. Os fatores de crescimento presentes na mídia facilitam o crescimento neuronal.

Gradualmente, os neurônios estendem seus axônios, que crescem no compartimento axonal através dos microsulcos.

A estreiteza dos sulcos impede a entrada de corpos celulares neuronais, garantindo a separação física das regiões somáticas e axonais.

Para começar, coloque um chip estéril com vários compartimentos em uma placa de Petri. Adicione 100 microlitros de uma solução de pré-revestimento ao poço superior esquerdo do cavaco e deixe-o fluir através do canal principal para o poço adjacente. Em seguida, encha o poço inferior esquerdo do chip com 100 microlitros da solução de pré-revestimento.

Desta vez, aguarde cinco minutos para permitir que a solução flua através das microranhuras. Agora, adicione 100 microlitros da solução de pré-revestimento ao poço superior direito e deixe-a fluir pelo canal principal para o poço adjacente. Após 90 segundos, encha o poço inferior direito com 100 microlitros da solução de pré-revestimento e incube o chip por 10 minutos.

Incline cuidadosamente a ponta da pipeta para longe do canal principal e aspire a solução de cada poço. Em seguida, adicione imediatamente 150 microlitros de PBS ao poço superior esquerdo e aguarde 1,5 minutos. Em seguida, adicione 150 microlitros de PBS ao poço inferior esquerdo e aguarde cinco minutos para permitir que o líquido flua através dos microsulcos.

Em seguida, adicione 150 microlitros de PBS aos poços superior direito e inferior direito nessa ordem. Após 10 minutos, aspire novamente o PBS e repita as etapas de lavagem uma segunda vez. Após a segunda lavagem, aspire o PBS dos poços como antes, inclinando a ponta da pipeta para longe da abertura do canal.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de poli-D-lisina de 0,5 mg por ml no poço superior esquerdo do chip. Aguarde 1 minuto e meio e, em seguida, encha o poço inferior esquerdo com 100 microlitros da solução de poli-D-lisina. Repita esse processo na metade direita do chip. Feche a placa de Petri e coloque o chip em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, enxágue o chip duas vezes com PBS conforme descrito anteriormente. Em seguida, aspire o PBS do dispositivo. Imediatamente, adicione 100 microlitros de meios de cultura de células ao poço superior esquerdo do chip. Após 1 minuto e meio, adicione mídia no canto inferior esquerdo.

Aguarde cinco minutos para permitir que a mídia flua pelas microranhuras e, em seguida, repita o processo de enchimento no lado direito do chip. Preparar uma suspensão celular de neurónios dissociados do hipocampo de ratos de acordo com protocolos estabelecidos. Remova a maioria dos meios em cada poço do chip, mas deixe os canais cheios.

Em seguida, carregue imediatamente 5 microlitros da suspensão celular no poço superior direito e outros 5 microlitros de suspensão celular no poço inferior direito. Ao carregar as células, aponte a ponta da pipeta para o canal principal. Depois de carregar as células, transfira o chip para um estágio de microscópio para garantir que os neurônios estejam no canal principal.

Depois de esperar 5 minutos para que as células se fixem, adicione aproximadamente 150 microlitros de meios de cultura neuronais a cada um dos poços superior e inferior direito. Em seguida, adicione 150 microlitros de mídia a cada um dos poços superior e inferior esquerdo. Cubra a placa de Petri e coloque o chip em uma bandeja umidificada em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius.