Cultura de explantes de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de multieletrodos

Comece com um segmento dissecado do ouvido interno do camundongo contendo o gânglio espiral e o órgão de Corti, estruturas especializadas do ouvido interno.

O órgão de Corti contém células ciliadas que atuam como receptores de sinais auditivos.

O gânglio espiral consiste em corpos celulares de neurônios que estendem processos para inervar as células ciliadas do órgão de Corti.

Separe o gânglio espiral do órgão de Corti e obtenha pequenas seções de tecido ou explantes dele.

Agora, pegue uma matriz de multieletrodos revestida com matriz extracelular contendo meios de cultura.

Coloque os explantes na matriz e posicione o órgão de Corti fora da área do eletrodo. Incubar.

Os explantes se ligam à superfície multieletrodo revestida.

Adicione regularmente meios contendo proteínas séricas e fatores de crescimento.

Durante a cultura, os componentes médios e o órgão de Corti fornecem suporte neurotrófico, promovendo o crescimento de neuritos dos neurônios do gânglio espiral sobre o multieletrodo.

Separe o órgão de Corti do gânglio espiral em modíolo, segurando a porção basal do gânglio espiral e o órgão de Corti com uma pinça e desenrolando lentamente o órgão de Corti da base ao ápice. Em seguida, corte os explantes laterais do gânglio espiral usando uma pinça ou tesoura ou faca de microdissecção fina.

Agora, transfira os explantes do gânglio espiral e o órgão de Corti para o MEA. Em seguida, coloque explantes SG sobre a área do eletrodo e o órgão de Corti, a aproximadamente 5 milímetros de distância da área do eletrodo. Coloque os explantes e o órgão de Corti nos MEAs, evitando danos ao tecido. Em seguida, coloque os MEAs cuidadosamente na incubadora e cultive a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.

No dia seguinte, inspecione visualmente os explantes quanto à sua ligação aos MEAs. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura contendo 10% de FBS e BDNF diariamente por cinco dias consecutivos. No dia 6, adicione 2 mililitros de meio de cultura, contendo 10% de FBS e 5 nanogramas por mililitro de BDNF, e cultive o tecido por mais 13 dias.