Reprogramação neuronal direta de astrócitos de camundongos em neurônios

Comece com uma placa de vários poços contendo astrócitos geneticamente alterados. Essas células são aderidas a uma lamínula colocada em um meio de astrócitos.

Essas células geneticamente modificadas expressam fatores de transformação que forçam sua transição para neurônios. Esse processo é chamado de reprogramação neuronal.

Tome um meio de diferenciação neuronal contendo moléculas específicas e o suplemento B27. Juntos, esses componentes fornecem nutrientes essenciais e fatores de diferenciação.

Substitua o meio astrócitos pelo meio de diferenciação neuronal.

Incube os astrócitos por um período necessário.

Durante a incubação, os fatores de transformação expressos pelos astrócitos desencadeiam uma sequência de eventos moleculares que permitem a conversão de um astrócito em neurônio.

Os neurônios convertidos têm corpos celulares menores e processos alongados, semelhantes aos neurônios típicos.

Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando um suplemento de B27 mililitro a 49 mililitros de meio de cultura básico. Após 24 a 48 horas, dependendo se as células foram transduzidas ou transfectadas, substitua o meio de astrócitos por um meio de diferenciação neuronal de mililitro por poço. Cultive as células a 37 graus Celsius com 9% de dióxido de carbono.

Para aumentar a eficiência de reprogramação, suplementar o meio de diferenciação neuronal com Forscolina e Dorsomorfina até uma concentração final de 30 micromolares e um micromolar, respectivamente, ao substituir o meio de astrócitos pelo meio de diferenciação. Ao optar por tratar as células com Forscolina e Dorsomorfina, forneça uma segunda dose de Dorsomorfina dois dias após o tratamento inicial. Adicione este segundo tratamento diretamente ao meio de cultura.