Preparando fatias cerebrais em cunha para visualizar neurônios auditivos

Comece com um cérebro de camundongo e disseque-o horizontalmente abaixo da parte posterior para preservar os neurônios auditivos cruciais para o processamento do som.

Monte a seção posterior em um disco magnético. Coloque um bloco de ágar para estabilizar o tecido durante o corte.

Transfira a seção para o estágio de uma câmara de fatiamento de um vibratomo equipado com uma lâmina.

Introduza um tampão frio e um gás carbógeno de bolha que forneça oxigênio e preserve a integridade dos neurônios.

Faça um corte horizontal uniforme para remover a parte superior da seção do cérebro.

Em seguida, incline o palco e continue cortando a seção restante até que a raiz do nervo auditivo fique visível.

Realinhe o palco. Em seguida, gire-o e ajuste a posição da lâmina para a espessura desejada da borda fina da fatia.

Afaste a lâmina e realinhe o stage para sua posição anterior. Agora, corte o cérebro em forma de cunha, mais grosso de um lado e mais fino do outro.

O lado mais grosso inclui a raiz nervosa auditiva, enquanto o lado mais fino apresenta neurônios auditivos interconectados.

Comece usando uma lâmina de barbear para cortar a pele na linha média do crânio, do nariz até a nuca. Retire a pele para expor o crânio e, começando na base do crânio e continuando em direção ao nariz, use uma tesoura pequena para fazer uma incisão no crânio através da linha média.

Na sutura lambda, faça cortes no crânio da linha média lateralmente em direção à orelha em ambos os lados para descascar o crânio e expor o cérebro. Começando na extremidade rostral, use uma pequena espátula de laboratório para levantar suavemente o cérebro do crânio para permitir que os nervos ópticos sejam cortados.

Continue a trabalhar suavemente o cérebro para trás, expondo a superfície ventral, e use uma pinça fina para beliscar cuidadosamente os nervos trigêmeos perto da superfície ventral do tronco cerebral para cortá-los. Coloque a preparação em uma placa de Petri de vidro cheia de solução de corte a frio e coloque a placa sob um microscópio de dissecação. Apare os nervos faciais próximos ao tronco cerebral para expor os nervos vestibulococleares.

Use uma pinça fina para empurrar as pontas para dentro do forame, onde o nervo vestibulococlear sai do crânio o mais longe possível. Aperte para cortar os nervos de ambos os lados, deixando a raiz nervosa presa ao tronco cerebral.

Remova as meninges e a vasculatura da superfície ventral do tronco encefálico perto do corpo trapezoidal. Em seguida, aperte os nervos cranianos restantes e o tecido conjuntivo para libertar completamente o cérebro do crânio, tomando cuidado para preservar a medula espinhal restante, se possível.

Para preparar a superfície do cérebro para fixação no palco, coloque o lado ventral do cérebro para cima e use uma ferramenta romba para imobilizar suavemente a medula espinhal para estabilizar o tecido cerebral. Insira uma pinça aberta em um ângulo de aproximadamente 20 graus através do cérebro até o fundo do prato, de modo que as pontas saiam da superfície dorsal do cérebro caudal ao quiasma óptico e use uma lâmina de barbear para cortar ao longo da pinça.

Em seguida, prepare um bloco de um centímetro cúbico de ágar 4% e espalhe uma pequena gota de cola em um retângulo no palco. Use uma pinça para levantar cuidadosamente o cérebro e enxugue suavemente o excesso de líquido com a ponta de uma toalha de papel. Em seguida, coloque a superfície bloqueada sobre a cola de modo que a superfície ventral fique voltada para a direção da lâmina durante o corte e empurre o bloco de ágar suavemente contra a superfície dorsal como suporte.

Para adquirir fatias em cunha com a raiz nervosa coclear no lado grosso e os neurônios medial, olivococlear e o núcleo medial do corpo trapezoidal no lado fino, coloque o disco magnético com o cérebro conectado no suporte do estágio e coloque o suporte na câmara de corte de um vibratomo com a superfície ventral do cérebro orientada para a lâmina. Encha a câmara com uma solução de corte gelada e baixe a lâmina na solução com bolhas de carbogênio.

Corte as fatias caudais à região de interesse para garantir que as fatias sejam simétricas. Em seguida, desloque o palco aproximadamente 15 graus para um lado. Continue cortando com cuidado até que a raiz do nervo auditivo esteja próxima à superfície de um lado e o nervo facial possa ser visto na superfície do outro lado da fatia.

Mude o estágio 15 graus de volta para a posição original e afaste a lâmina do tecido. Gire a base do palco 90 graus para que a borda lateral do lado fino fique voltada para a lâmina e abaixe a lâmina várias centenas de mícrons antes de aproximar lentamente a lâmina da borda do tecido. Com a lâmina ligeiramente retraída, abaixe a lâmina até a espessura desejada da borda fina da fatia.

Mova a lâmina para trás do tecido e gire a base do palco para trás de modo que a superfície ventral fique voltada para a base do palco. Faça um corte para designar a superfície rostral da fatia em cunha e transfira a fatia para um pedaço de papel de interface de um centímetro quadrado. superfície caudal para baixo.

O nervo facial deve ser visível em ambos os hemisférios do corte na superfície rostral. Em seguida, mova a fatia para uma câmara de incubação de 35 graus Celsius para se recuperar por 30 minutos.