Estimulando a diferenciação celular neuronal usando nanobastões de ouro

Comece com células nervosas cultivadas em um meio de diferenciação celular.

Adicione nanobastões de ouro no meio.

Incubar para permitir que a célula engula o nanobastão por meio de um processo chamado endocitose.

Estimule os nanobastões com um laser.

O feixe de laser excita os elétrons da superfície no nanobastão. Os elétrons excitados então retornam ao estado fundamental, liberando energia térmica.

Esse calor estimula as células nervosas a produzir projeções apoiadas por uma proteína específica do citoesqueleto chamada βIII-tubulina.

Remova o meio gasto.

Corrija as células. Adicione um detergente adequado para permeabilizar a membrana.

Adicione um agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos.

Rotule as células com anticorpos primários que têm como alvo a βIII-tubulina.

Adicione anticorpos secundários marcados com fluorescência que interagem com os anticorpos primários.

Manchar o núcleo com um corante fluorescente azul.

Usando microscopia de epifluorescência, observe células vermelhas com núcleos azuis.

Projeções alongadas da célula indicam diferenciação de células nervosas.

Cultive as células neuronais NG108-15 em 10 mililitros de meio de cultura de células em um frasco T75 e, posteriormente, incube-o a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada. Quando as células estiverem 70% a 80% confluentes, troque o meio por meio quente e fresco.

Depois disso, separe mecanicamente as células batendo suavemente no fundo do frasco confluente. Centrifugar uma suspensão celular durante cinco minutos a 600 g e ressuspender o sedimento celular em 2 mililitros de meio de diferenciação celular quente. Em seguida, semeie as células em uma placa de 96 poços, com 200 microlitros de meio de diferenciação celular.

Incubar a amostra por um dia a 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione a solução de nanobastões de ouro e incube-a por mais 24 horas. Neste procedimento, acople o laser a uma fibra óptica monomodo e finalize-o com um conector FC. Meça a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão.

No dia 3 da incubação de nanobastões, fixe o conector FC no poço, irradie a amostra e o controle à temperatura ambiente por 1 minuto em uma onda contínua em diferentes potências de laser. No dia 5, remova o meio de diferenciação celular da amostra e fixe-o com solução de formaldeído a 3,7% volume por volume por 10 minutos.

Em seguida, permeabilize as células com 0,1% de volume por volume Triton X-100 por 20 minutos. Em seguida, adicione 3% de peso por volume de BSA à amostra por 60 minutos para bloquear os locais de ligação às proteínas que não reagiram. Rotule a amostra com anti-beta-3-tubulina durante a noite a 4 graus Celsius.

No dia seguinte, incube as células por 90 minutos no escuro, com um anticorpo secundário apropriado. Em seguida, rotule os núcleos celulares com DAPI por 10 minutos e, em seguida, obtenha imagens da amostra com epifluorescência ou microscopia confocal, usando pelo menos uma objetiva de 20x. Escolha os filtros do microscópio de acordo com o anticorpo secundário e selecione o filtro DAPI para visualizar os núcleos das células.