Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:10 min. • July 8th, 2025
Comece com embriões de peixe-zebra em estágio inicial de desenvolvimento em meios embrionários.
Remova o córion, a membrana protetora que envolve os embriões, e transfira os embriões para uma nova placa de cultura contendo meio.
Remova a parte da cauda do embrião, separe a cabeça e retire suavemente os olhos da cabeça.
Os olhos contêm a retina, uma fina camada de tecido que abriga as células ganglionares da retina.
Transfira os olhos para um tubo contendo meios de cultura de células de peixe-zebra.
Dissocie mecanicamente os olhos para liberar as células ganglionares da retina e formar uma suspensão unicelular.
Pegue lamínulas colocadas em uma placa de cultura contendo meios de cultura de peixe-zebra.
As lamínulas são revestidas com um polímero sintético e uma proteína de adesão.
Transfira as células para o centro da lamínula e incuba.
As células ganglionares da retina se ligam às superfícies revestidas e, além disso, essas células desenvolvem longas projeções chamadas axônios.
Recupere embriões de peixe-zebra da incubadora e mergulhe os embriões em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo 70% de etanol, por 5 a 10 segundos para esterilizá-lo. Usando uma pipeta de transferência, transfira os embriões para o prato E2 Media #1 contendo meio E2 estéril para lavar o excesso de etanol. Em seguida, transfira os embriões para o prato E2 Media # 2 e remova seus córions com uma pinça afiada. Finalmente, transfira os embriões para a placa E2 Media #3 para realizar dissecações.
Usando um par de pinças finas, posicione e segure os embriões anteriores à gema com uma das pinças e remova a cauda posterior ao saco vitelino com a outra pinça. Agarre o pescoço com uma pinça e retire a cabeça para expor o cérebro e os olhos à mídia E2. Com a ponta de uma pinça fina, role suavemente os olhos da cabeça enquanto segura o tecido craniano com a segunda pinça. Transfira quatro olhos para um dos tubos previamente preparados contendo ZFCM+.
Triture suavemente para cima e para baixo com a pipeta P20 cerca de 45 vezes para dissociar as células. Transfira o ZFCM+ com as células dissociadas para o centro das lamínulas. Mantenha as culturas na bancada a 22 graus Celsius, em um rack de espuma de poliestireno para absorver as vibrações. No dia da imagem, verifique as células ao microscópio para validar o crescimento dos axônios RGC.