Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:50 min. • July 8th, 2025
Pegue um tecido cerebral humano imerso em uma solução de corte. O pH biológico e os nutrientes da solução ajudam a manter a funcionalidade do tecido.
Remova a camada de meninges mais externa e apare o tecido para criar uma superfície plana.
Seque o excesso de solução do tecido. Prenda o tecido aparado a um disco de amostra com um bloco de agarose, mantendo o tecido em contato com o bloco para facilitar a secção.
Coloque o disco em uma bandeja tampão de vibratomo e cubra o tecido com uma solução de corte gelada.
Usando o vibratome, gere cortes uniformes que preservam a arquitetura do tecido.
Apare o excesso de tecido, garantindo uma proporção consistente de matéria cinzenta e branca.
Coloque as fatias em uma placa multipoços contendo um meio de cultura e incuba.
As fatias permanecem suspensas no meio para garantir o acesso uniforme aos nutrientes, uma técnica conhecida como cultura de fatias flutuantes.
Reabasteça regularmente a cultura com um meio suplementado com fator de crescimento neural para manter a viabilidade do tecido.
Transfira a amostra para uma placa de Petri contendo solução para fatiar. Usando ferramentas cirúrgicas finas, remova cuidadosamente o máximo possível das meninges restantes. Escolha a melhor orientação da amostra para produzir fatias com as características particulares do projeto experimental e use uma lâmina de bisturi número 24 para aparar uma superfície plana para ser a base que será colada ao disco da amostra.
Usando uma colher de plástico descartável e pincéis delicados, colete o fragmento da placa de Petri e seque o excesso de solução com papel de filtro. Em seguida, use super cola para prender o tecido ao prato de amostra de vibratomo até que esteja firmemente aderido ao prato e em contato com o bloco de agarose.
Coloque o disco de amostra do vibratome na bandeja do buffer do vibrato. Trave o porta-faca no lugar com a lâmina de barbear firmemente fixada. Adicione a solução de corte e certifique-se de que está cobrindo a amostra e a lâmina. Em seguida, comece a cortar a amostra em fatias de 200 micrômetros.
Transfira as fatias da bandeja tampão para uma placa de Petri contendo solução de corte e apare as bordas soltas e o excesso de substância branca em uma proporção de aproximadamente 70% de córtex e 30% de substância branca. Em um gabinete de fluxo laminar, adicione 600 microlitros de meio de cultura a cada poço de uma placa de 24 poços e incube a 36 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos antes de plaquear as fatias. Depois disso, use um pincel para colocar uma fatia em cada poço.
Se houver poços não utilizados na placa, encha-os com 400 microlitros de água estéril. Incube a 36 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Suplementar 10 mililitros do meio de cultura previamente preparado com fator neurotrófico derivado do cérebro a uma concentração de 50 nanogramas por mililitro.
Após 8 a 16 horas, remova 333 microlitros do meio condicionado de cada poço e adicione 133 microlitros de meio fresco suplementado com BDNF. Substitua um terço do meio condicionado por meio fresco suplementado com BDNF a cada 24 horas.