Isolamento e cultura de microglia de cérebros de ratos usando meios sem soro

Pegue um cérebro de rato perfundido. Pique-o em pequenos fragmentos.

Homogeneizar o tecido em um tampão para liberar células, incluindo a microglia.

Assim que o tecido não digerido assentar, colete as células contendo sobrenadante e adicione um tampão de separação de mielina.

Misture o conteúdo e centrifugue para separar as células da mielina e dos detritos. Remova a camada de detritos de mielina e o sobrenadante.

Ressuspenda as células no tampão e pipete para separar os aglomerados.

Passe a suspensão por um filtro para remover os agregados celulares restantes.

Transfira as células filtradas para uma placa de cultura revestida com anticorpos monoclonais específicos da micróglia. Incubar para facilitar a adesão da microglia.

Lave com tampão para remover as células não aderentes. Adicione tripsina e incube para soltar a microglia.

Remova a tripsina.

Adicione mídia sem soro. Incube no gelo para enfraquecer as interações célula-substrato.

Pipete e recolha a suspensão em um tubo. Centrifugue e remova o sobrenadante.

Ressuspenda a microglia em meio sem soro e transfira para uma placa de vários poços revestida de colágeno. Incubar para facilitar a adesão da microglia.

Adicione meios com fatores de crescimento e lipídios. Incubar para maturação da microglia.

Depois que os cérebros forem coletados em DPBS frio, pique cada cérebro em pedaços de um milímetro cúbico em uma placa de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi fria e transfira para um homogeneizador Dounce gelado com 5 a 7 mililitros de tampão de duplicação gelado. Em seguida, use um homogeneizador Dounce solto para dissociar o tecido com 10 a 20 movimentos suaves e incompletos. Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogeneizador. Em vez disso, impulsione o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogeneizador.

É importante homogeneizar lentamente o tecido com várias rodadas de duplicação para preservar a viabilidade da microglia.

Depois, remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Permita que pedaços de tecido mal dissociados se depositem no fundo do homogeneizador e transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mililitros resfriado. Em seguida, substitua o volume removido por um tampão de ducição novo e repita o procedimento de dissociação por um total de três a quatro rodadas ou até que todo o tecido tenha sido dissociado.

Neste procedimento, adicione tampão de duplicação gelado ao tubo cônico de 50 mililitros contendo a suspensão celular e ajuste o volume total para 33,5 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de MSB à suspensão celular e misture bem invertendo o tubo várias vezes. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mililitros.

Em seguida, centrifugue as células durante 15 minutos a 500 g a 4 graus Celsius com travagem lenta. Em seguida, remova a camada superior de mielina e detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir que o máximo possível seja removido.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 12 mililitros de tampão panorâmico. Triture suavemente a suspensão celular, para quebrar quaisquer aglomerados de células restantes. Nesta etapa, passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 micrômetros para remover grandes detritos ou aglomerados de células. Lave o prato panorâmico revestido com OX42 três vezes com DPBS. Não deixe a placa secar completamente entre as lavagens.

Despeje a última lavagem do DPBS e aplique a suspensão de células filtradas no prato panorâmico. Gire suavemente a placa para distribuir as células. Em seguida, incube a placa em uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 minutos para permitir que as células adiram. Não incube por mais de 20 minutos, ou as células ficarão muito difíceis de recuperar do prato. Em seguida, lave o prato panorâmico com DPBS 10 vezes para remover as células não aderentes.

A microglia ficará firmemente presa à placa, portanto, gire a placa a cada enxágue para garantir a remoção de outras células não aderentes. Despeje a última lavagem do DPBS e substitua por 15 mililitros de DPBS e 200 microlitros de tripsina.

Para tripsinizar as células, incube o prato por menos ou igual a 10 minutos a 37 graus Celsius. Após 10 minutos de tripsinização, a microglia ainda estará presa à placa. Despeje a mistura e lave suavemente a placa duas vezes com DPBS para remover a tripsina. Em seguida, substitua por 12 mililitros de MGM gelado.

Em seguida, coloque o prato panorâmico no gelo por dois minutos para ajudar a enfraquecer a interação celular e substrato e certifique-se de que o prato esteja plano para evitar que as áreas do prato sequem. Depois disso, pipete vigorosamente com uma pipeta de 10 mililitros e um controlador de pipeta em alta velocidade para recuperar as células do prato panorâmico. Desenhe uma grade de 16 por 16 com o fluxo de líquido da pipeta para tentar remover todas as células.

É importante encontrar um equilíbrio entre a recuperação celular geral e a saúde de sua cultura. A pipetagem repetida de um sobrenadante celular contra o prato panorâmico resultará na redução da viabilidade de sua cultura.

Verifique as células ao microscópio com ampliação de 20x para certificar-se de que elas se desprenderam da placa. Marque os pontos no topo do prato onde as células estão presas e repita a pipetagem nessas áreas. Recolher a suspensão celular e alíquota de 3 a 4 mililitros de sobrenadante em cada tubo cónico de 15 ml. Gire por 15 minutos a 500 g a 4 graus Celsius com frenagem lenta.

Após 15 minutos, aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mililitros de MGM com o pellet celular. Em seguida, ressuspenda cada pellet no MGM restante e agrupe as células de todos os tubos. Em seguida, conte as células com o hemocitômetro.

Agora, coloque 15 microlitros de revestimento de colágeno IV diretamente no centro de uma placa de cultura de tecidos aniônica de 24 poços com revestimento catiônico e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Depois de contar as células com um hemocitômetro, dilua-as para 2,3 x ^10-5 por mililitro em MGM. Aspire o ponto de colágeno IV e imediatamente coloque 15 microlitros de suspensão celular neste local para produzir 3,5 x 10³ células por ponto.

Em seguida, incube por cinco a dez minutos a 37 graus Celsius para permitir que as células adiram. Em seguida, adicione suavemente 500 microlitros de TIC equilibrado com CO₂ ao poço.