Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:30 min. • July 8th, 2025
Pegue um olho de rato intacto no líquido cefalorraquidiano artificial, ou aCSF, e faça uma incisão para isolar a ocular que contém a retina.
Trate com uma solução enzimática para remover a membrana limitante interna, expondo as células neuronais.
Mergulhe o tecido em uma solução de inibição para interromper a digestão e lave para remover o excesso de solução.
Coloque o tecido em uma incubadora especializada a baixa temperatura para retardar o metabolismo celular, preservando o tecido.
Esta incubadora compreende uma câmara principal com uma malha para montagem de tecidos. A câmara é preenchida com aCSF e sua temperatura e pH são controlados para preservar a funcionalidade do tecido.
Para eliminar a contaminação microbiana, o aCSF é bombeado para outra câmara e tratado com radiação ultravioleta para matar quaisquer micróbios.
O aCSF esterilizado é então bombeado de volta para a câmara principal.
Para isolar a retina, remova a ocular, separe a retina do tecido circundante e devolva-a à incubadora.
Para a preparação de toda a montagem da retina, enuclee imediatamente os olhos de um animal sacrificado. Faça um pequeno corte ao longo da ora serrata e coloque os olhos em Ames Media ou aCSF com suprimento de carbogênio em temperatura ambiente. Depois disso, remova imediatamente a córnea, o cristalino e o vítreo cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e remova-os com uma pinça. Coloque o tecido no sistema de incubação à temperatura ambiente.
Para remover a membrana limitante interna, transfira a ocular contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo papaína, L-cisteína, EDTA e DNAse a 37 graus Celsius por 20 minutos. Aplique carbogênio na solução através da tampa, mas não borbulhe. Pare a digestão enzimática colocando o tecido em uma solução ovomucóide e BSA por 10 minutos em Earl's BSS. Em seguida, lave bem o tecido com aCSF.
Posteriormente, transfira o tecido para o sistema de incubação e reduza a temperatura para cerca de 15 a 16 graus Celsius. Em seguida, transfira o tecido da retina para o microscópio; Isole a retina da ocular e corte-a em quatro pedaços com uma lâmina de barbear. Se toda a retina for necessária, faça quatro pequenos cortes na periferia da retina para permitir que ela fique plana.
Este tecido agora pode ser transferido para o microscópio para eletrofisiologia ou mantido no Braincubator. O tecido é mantido na câmara principal que contém as sondas para medições de pH e temperatura. Uma segunda câmara é isolada da câmara principal e é exposta a luz UVC de 1,1 watts para irradiar bactérias que flutuam na solução. Use uma bomba peristáltica para circular o aCSF pelas duas câmaras e uma placa fria termoelétrica Peltier para resfriar ou aquecer a câmara principal.